Наиболее распространённые методы секвенирования нуклеиновых кислот основаны на электрофоретическом разделении терминированных фрагментов ДНК в полиакриламидном геле. До недавнего времени этот подход был вне конкуренции, но сейчас у него появился достойный соперник — пиросеквенирование. Оно основано на определении пирофосфата, образующегося при синтезе ДНК, и имеет следующую предысторию:

• 1985 год — шведские учёные Pål Nyren и Arne Lundin разработали чувствительный люминометрический метод определения пирофосфата [1];
• 1987 год — P. Nyren разработал метод анализа ДНК-полимеразной активности, основанный на определении пирофосфата [2];
• 1988 год — Edward Hyman предложил использовать этот метод для секвенирования ДНК [3];
• 1990 год — им же получен патент на пирофосфатный метод секвенирования нуклеиновых кислот [4];
• 1997 год — в Швеции учреждена компания "Pyrosequencing" (с 2003 года — "Biotage AB"), специализирующаяся на разработке, производстве и продаже приборов и тест-систем медицинского назначения [5];
• 2000 год — в США учреждена компания "454 Life Sciences", занимающаяся разработкой методов геномного пиросеквенирования [6];
• 2004 год — компания "454 Life Sciences" получает от NIH гранты на совершенствование своего метода геномного секвенирования (май — 2,4 млн. $) и на разработку ультрамикрометода секвенирования геномов человека (октябрь — 5 млн. $ на 3 года) [7].

Повышенный интерес NIH США к этой технологии вполне объясним. К началу 2004 года компания "454 Life Sciences" продемонстрировала работоспособность своего подхода, а к концу года завершила секвенирование полных геномов нескольких бактерий (рис. 1).

Принцип метода довольно прост и основан на (+/-)-секвенировании, предложенном ещё в 60-х годах. При последовательном добавлении к ДНК-полимеразному комплексу дезоксинуклеозидтрифосфатов их включение в синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы. Полимеразный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата. Этот пирофосфат в присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и запускает окисление люциферина люциферазой, сопровождающееся биолюминесценцией (рис. 2). Люминесценция регистрируется фотоумножителем или цифровой камерой.

Приборное оснащение, необходимое для проведения пиросеквенирования, на первых порах не отличалось особой сложностью. В первоначальном варианте, описанном Hyman, предлагалось использовать проточный капилляр, содержащий несколько иммобилизованных ферментов и анализируемую ДНК [3]. Корпорация "Biotage AB" (Швеция) предлагает приборы для работы с 96-луночными планшетами. Реагенты вводятся в лунки головкой струйного принтера, после чего не удаляются, а расщепляются специальным ферментом — апиразой.

Существенной особенностью более сложной технологии, разработанной компанией "454 Life Sciences", является использование эмульсионной ПЦР для одновременной параллельной подготовки сотен тысяч препаратов ДНК к секвенированию. Такая пробоподготовка состоит из следующих этапов:

• ультразвуковая фрагментация (небулизация) анализируемой ДНК;
• пришивка адапторов и денатурация ДНК;
• получение эмульсии, содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и полистирольные шарики с пришитым праймером;
• проведение эмульсионной ПЦР (emPCR);
• отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязянных с шариками нитей ДНК;
• загрузка шариков в лунки проточной камеры;
• загрузка лунок микрошариками с иммобилизованными ферментами.

Основные этапы пробоподготовки показаны на рис. 3.

Ещё одной изюминкой технологии, разработанной компанией "454 Life Sciences", являются специальные проточные камеры (PicoTiterPlate^TM). Они содержат сотни тысяч микролунок, заполняемых шариками с образцами анализируемой ДНК и микрошариками с иммобилизованными ферментами (рис. 4).

Пиросеквенатор "454 Life Sciences" состоит из комплекта бутылей с реагентами, управляемого компьютером многоканального насоса, проточной ячейки и чувствительной цифровой фотокамеры (рис. 5.).

При пропускании реагентов через проточную ячейку регистрируются люминесцентные сигналы, излучаемые сотнями тысяч микролунок. На димерных, тримерных и тетрамерных нуклеотидных повторах интенсивность сигналов пропорционально увеличивается. В то же время надёжно дифференцировать гомогенные тетрамеры и пентамеры уже практически невозможно, что затрудняет секвенирование последовательностей с протяжёнными нуклеотидными повторами.

Протяжённость секвенируемых участков ДНК может превышать 100 оснований (рис. 6).

Представленные иллюстрации взяты с сайта www.454.com , на котором можно найти много победных реляций, но недостатки данной технологии там не рассматриваются и о них приходится только догадываться по некоторым косвенным признакам и публикациям. Например, в ранних экспериментах дАТФ давал высокое фоновое свечение. Причиной могли быть или примеси АТФ, или недостаточно высокая специфичность люциферазы. Для решения этой проблемы было предложено заменить дАТФ её аналогом с фосфотиоатной группой в альфа-положении (dATPS) [8] или Sp-стереоизомером этого фосфотиоата [9].

Ещё одна проблема – большой расход растворов, пропускаемых через проточную ячейку. Все они содержат аденозинфосфосульфат, люциферин и особо чистые dNTP, один из которых к тому же химически модифицирован (dATP S). Высокие требования к чистоте dNTP обусловлены ещё и тем, что в их растворах из-за спонтанного гидролиза высокоэнергетических связей может накапливаться пирофосфат. Поэтому уже в самой первой работе, посвящённой пиросеквенированию, предлагалось пропускать растворы через микроколонку с иммобилизованной пирофосфатазой [3].

Лабильность и повышенные требования к чистоте препаратов dNTP могут служить серьёзными препятствиями для широкого применения пиросеквенирования. Кроме того, если выбрасывать все растворы после их прокачивания через проточную ячейку, то стоимость такого секвенирования будет непомерно высока. Отсюда можно сделать вывод о необходимости дополнительной очистки коммерческих препаратов непосредственно перед их использованием и об обязательной реутилизации всех отработанных растворов. Таким образом, на приведённой ниже фотографии (рис. 7) за кадром осталась целая биохимическая лаборатория по очистке и реутилизации реактивов.

По мнению исполнительного директора компании "454 Life Sciences" разработанные ими приборы могут устанавливаться как в крупных геномных центрах, так и в небольших госпитальных лабораториях [6]. В отношении геномного секвенирования его правота уже не вызывает сомнений, а вот для небольших лабораторий технология пиросеквенирования потребует значительной доработки.

Особенно актуальным представляется использование секвенирования для диагностики инфекционных болезней. Количество патогенных бактерий и вирусов измеряется сотнями или даже тысячами, поэтому все респираторные инфекции проходят под общим названием ОРЗ. Даже грипп диагностируется, как правило, не по объективным показателям, а по косвенным симптоматическим признакам и в соответствии с циркуляром Минздрава. До прихода такого циркуляра обычные врачи ставят диагноз ОРЗ, а наиболее образованные — ОРВИ. Широкое внедрение секвенирования в диагностику инфекционных болезней позволило бы поднять на качественно новый уровень всю систему биобезопасности, но для этого необходимо значительно удешевить реактивы и упростить приборное оснащение.

Геномное секвенирование требует прочтения сотен тысяч или даже миллионов фрагментов ДНК максимально достижимой длины. Для диагностики инфекционных болезней достаточно располагать информацией о нескольких тысячах коротких (20-30 оснований) последовательностей, находящихся в анализируемой пробе. Это позволяет значительно уменьшить расход реагентов, понизить требования к их чистоте и упростить конструкцию секвенатора.

Аденозинфосфосульфат по каталогу "Sigma" стоит около 500€ за 50 mg, но в литературе описан простой метод его синтеза из аденозинмонофосфата и трёхокиси серы [10]. D-люциферин той же фирмы стоит примерно столько же, но за эти деньги в Германии можно приобрести люциферина не 50 mg, а 1 g [11]. Кроме того, его синтезом, а также получением рекомбинантной люциферазы, успешно занимаются на химфаке МГУ [12]. Производство дезоксинуклеозидтрифосфатов освоено в Новосибирске (ЗАО "БИОСАН") [13] и в Пущино (ФИБХ). По-видимому, синтез фосфотиоатного аналога дАТФ для наших химиков также не окажется неразрешимой проблемой. Таким образом, производство всех необходимых для пиросеквенирования реактивов может быть налажено в России.

Проточная камера фирмы "454 Life Sciences" размером 60х60 мм содержит два поля по 800 тысяч рабочих ячеек (лунок). При допустимом уменьшении количества ячеек на 1-2 порядка размеры можно будет уменьшить до 20х20…6х6 mm, но общее количество таких камер желательно увеличить. Если на секвенирование каждой анализируемой пробы будет тратиться более часа, то однокамерного прибора для рутинной генодиагностики будет недостаточно.

Многокамерная проточная система может монтироваться на базе приборов, предназначенных для твердофазного синтеза биополимеров. Подобные приборы обеспечивают дозированное прокачивание реагентов через микроколонки, которые можно заменить проточными камерами для пиросеквенирования. Основой для диагностического секвенатора может служить, например, показанный на рис. 8 восьмиканальный синтезатор ДНК ASM-800 [14].

Оснащение подобного синтезатора системой регистрации люминесценции позволяет переоборудовать его в пиросеквенатор, но охлаждаемые цифровые фотокамеры пока слишком дороги, а менее дорогие модели могут оказаться недостаточно чувствительными. Для решения этой проблемы необходимо постараться повысить квантовый выход биолюминесценции и увеличить общее количество пирофосфата, выделяемого ДНК-полимеразными комплексами.

Ещё одна проблема заключается в необходимости очистки реагентов непосредственно перед использованием, а также их регенерации. По-видимому, диагностические пиросеквенаторы должны или иметь встроенную систему очистки-регенерации, или поставляться в комплекте с автоматизированным хроматографическим комплексом. Примером может служить вышеупомянутый синтезатор ДНК, комплектуемый при необходимости установкой для очистки олигонуклеотидов OPS-201 (рис. 9) /14/.

В целом необходимо отметить, что недавние успехи компании "454 Life Science" продемонстрировали значительные преимущества пиросеквенирования перед традиционными подходами, и в ближайшем будущем должно начаться широкое внедрение этого метода в лабораторную практику. В результате секвенирование, называемое золотым стандартом генодиагностики, должно заменить многочисленные тест-системы, основанные на методах направленной амплификации нуклеиновых кислот. Хотелось бы, чтобы в этом процессе приняла участие и Россия, причём не в роли аутсайдера, а в жёлтой майке лидера.

Список литературы