molbiol.ru -> Western blotting

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Western blotting -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: Western
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (5): < 1 2 3 4 5 >

Raido

Москва

18.09.2009 11:15

URL #101

Здравствуйте!
Помогите, пожалуйста, разобраться!
1) Работаю с белком 170 кДа (то есть вырезаю полоску по маркеру: от 130 до 250 кДа). Однако перенос на PVDF-мембрану маркера 250 кДа происходит не всегда эффективно (при всех равных условиях: ток 60 мА, перенос - 2 ч, в буфере для переноса 10 % этанол). То есть вчера перенос прошел полностью, а сегодня - приблизительно на 60 % (по интенсивности). Существует ли логическое объяснение наблюдаемому явлению?

2) При детекции с использованием 2-х антител с пероксидазой хрена столкнулась со следующей проблемой: после проведения 1 минутной реакции с перекисью, люминолом и кумаровой кислотой, без промедления закладываю пленку. При экспонировании 5 сек на пленке наблюдаются все бенды, а при увеличении времени экспонирования до 1 мин - бендов, соответствующих дорожкам в середине, уже нет!! Аналогичная картина и при 5 мин! Полоски физически не деформировались и не смещались. Куда "пропали" бенды и почему так быстро? Проблема в антителах? (Разведение вчерашнее, но сами антитела старенькие - им больше года). Хотя две недели назад, используя эту же систему детекции (и антитела), я получила отличную картинку.
В общем, мистика какая-то...%)

Nameless
Постоянный участник
CA

18.09.2009 17:29

URL #102

Попробуйте 400 мА/2 часа в холодной комнате/холодильнике/на льду.

Belousoff
Участник
Москва

19.09.2009 23:54

URL #103

2 Raido по поводу вопроса №2.
Есть в вестерне такая вещь как выгорание сигнала - с ней вы и столкнулись. Обычно это происходит при значительном избытке первичных или вторичных антител. Собственно то, что после 5-секундной экспозиции у вас уже видны все нужные бэнды, говорит о том, что антител можно брать в разы меньше. Подкорректируйте разведения первичных и вторичных АТ так, чтобы оптимальная картинка получалась после 30-60-секундной экспозиции - в этом случае сигнал будет выгорать гораздо медленнее, и вы сможете спокойно сделать fine-tuning времени экспонирования.

Guest
IP-штамп: frwzUkJeG5fZ.
гость

20.09.2009 22:00

URL #104

-Существует ли логическое объяснение наблюдаемому явлению?
Да! Например поменялась площадь фильтровашки(ватмана) в полусухом переносе.
Или у вас происходит неравномерный перенос по площади элетродов и вы кладете гель в разные места электродов.

Raido

Москва

21.09.2009 05:08

URL #105

Спасибо за помощь. Обязательно учту ваши комментарии в следующий раз.

Marinka Ts

25.09.2009 15:27

URL #106

Здравствуйте! Помогите, пожалуйста! Скажите, кто-нибудь работал с таким хемилюминецентным субстратом для щелочной фосфатазы, как CDP-star (вместе с Nitroblock-enhancer)? нам его доставили почему-то без инструкции, а в руководстве, поданном на сайте производителя (Applied Biosystems), сказано только, что он 20-кратный и водорастворимый. чем отличаются условия проявки от ECL? можно ли разводить больше, чем в 20 раз (реагента мало, он дорогой)? заранее благодарна за любые советы.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

25.09.2009 16:44

URL #107

-емилюминецентным субстратом для щелочной фосфатазы,

Попробуйте почитать про аналог у Роша. (Вообще я сильно подозреваю что АВ впродает или производит по лицензии Роша). ЩФ работает гораздо медленнее ПХ поэтому засвечиваться можно оставлять на ночь.

Statin
Постоянный участник

26.09.2009 20:33

URL #108

Вопрос к специалистам по Western-blot, где можно заказать антитела к GAPDH или бета-актину?

Guest
IP-штамп: frTTCS0/dAHf2
гость

27.09.2009 18:30

URL #109

-Вопрос к специалистам по Western-blot, где можно заказать антитела к GAPDH или бета-актину?

Ваш вопрос не имеет отношения к блоту и к специалистам

Краткий ответ: в магазине.

angel eyes The bad

Россия, Е-бург

27.09.2009 19:06

URL #110

Название магазина : Abcam

Statin
Постоянный участник

27.09.2009 19:18

URL #111

"Название магазина : Abcam"
Если можно ссылочку, заранее спасибо.

lna

Новосибирск, Paris

05.10.2009 14:07

URL #112

подскажите пожалуйста, где искать подвох!
на SDS-геле не вижу классического бромфенолового синего фронта. напротив, краска идет в каждой дорожке отдельным бэндом, много выше предполагаемого фронта. маркер (prestained) разделяется как на картинке производителя.. единстевнное, есьб ощущение, что форез идет бытсрее, чем надо.
это все сразу выкинуть или помучаться?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

05.10.2009 15:08

URL #113

Возможно это не БФС. Возможно что-то напутано с рН( проверте по индикаторной бамажке), но если маркер красив, то скорее всего краска-свидетель не адекватна.

akimovster
Постоянный участник
Новосибирск

06.10.2009 05:20

URL #114

Уважаемые коллеги! У меня несколько вопросов:
1.Можно ли PBS в используемых растворах заменить на воду mQ? Если да, то в каких?
2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях?
Спасибо!

Сообщение было отредактировано akimovster - 06.10.2009 05:21

guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость

06.10.2009 08:44

URL #115

-1.Можно ли PBS в используемых растворах заменить на воду mQ? Если да, то в каких?

Можно, в тех, в которых это не скажется на качестве.

-2.После забивки, промывки RB, отмывки в спирте и высушивания, можно ли хранить мембрану, если да, то какое время и при каких условиях?

Можно. При комнатной температуре между двух фильтровашек под прессом. До тех пор пока там еще, что-то можно окрасить.

Иван! Каков вопрос таков ответ. Если хотите получить что-то вразумительное, пишите вразумительно: используйте меньше сокращений и описывайте подробнее и конкретнее интересующую вас ситуацию.

akimovster
Постоянный участник
Новосибирск

07.10.2009 11:40

URL #116

- "Иван! Каков вопрос таков ответ. Если хотите получить что-то вразумительное, пишите вразумительно: используйте меньше сокращений и описывайте подробнее и конкретнее интересующую вас ситуацию."

- Хорошо. Ситуация такая: хочу секономить PBS.
1.Можно ли после переноса хранить мембрану несколько дней не в растворе PBS, а в автоклавированной воде mQ?
2.Можно ли для промывки использовать 0.05% tween-20 / в воде?
3.Можно ли антитела разводить в 0.05% tween-20 / в воде?

Не повлияет ли это деструктивно на белки, антитела и мембрану?
Спасибо!

angel eyes The bad

Россия, Е-бург

07.10.2009 11:54

URL #117

"Ситуация такая: хочу секономить ПБС"
Нашли на чем економить Ну лень делать ПБС сделайте ТБС 50мМ трис 150мМ соли 7.5
Мембрану после переноса можно хратить просто завернув в саран и на +4.
Про остальное я не експериментировал, а то економия выдет дополнительными рас ходами

akimovster
Постоянный участник
Новосибирск

06.11.2009 07:05

URL #118

(guest: ммм @ 14.07.2008 19:51)

--БСА в какой коцентрации? и Вчём растворять?
А молоко в чем растворяете?

0.5% БСА в PBS, молоко - тоже...

akimovster
Постоянный участник
Новосибирск

26.11.2009 11:19

URL #119

Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

26.11.2009 16:23

URL #120

-0.5% БСА в PBS, молоко - тоже...
Угу! Тоже! 5% молоко можно даже 10%.

-Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!
Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится.

smmuscle
Участник

04.12.2009 03:37

URL #121

(guest: ммм @ 26.11.2009 17:23)

-0.5% БСА в-Товарищи! Можно ли замораживать водный раствор (в PBS)БСА? Спасибо!
Можно, можно если вы его для забивки используете, но лучше сделать сток 10%, он так на морозе лучше хранится.

И лучше открутить после разморозки, чтобы удалить аггрегировавший БСА (15000g)

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

20.01.2010 16:55

URL #122

Для проявки в ДАБе дали рекомендацию добавить 5мМ хлорида кобальта. А зачем его туда добавлять? И можно ли его заменить например хлоридом стронция?
В принципе работает и без него, но просто любопытно стало...

Сообщение было отредактировано plotter - 20.01.2010 16:57

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

20.01.2010 17:18

URL #123

Нельзя .

И Вот почему кобальт образует окрашенные комплексные соединения с продуктом окисления ДАБ в результате повышается глубина окраски и чувствительность. А стронций а) бесцветный, б) Комплексы если и образует, то крайне непрочные.

Кроме кобальта еще используют соли Никеля.

plotter
Постоянный участник
Стыдно признаваться о том, где живу...

20.01.2010 17:21

URL #124

Благодарствую.

Крыска
Участник

08.02.2010 12:28

URL #125

Вопрос наверно глупый, т.к. основан на домыслах, но все-таки
Можно ли при использовании ПВДФ мембраны пользоваться трансфер буффером на Этаноле или в этом случае только метанол???

smmuscle
Участник

08.02.2010 13:35

URL #126

Можно и на этаноле и на метаноле!

Крыска
Участник

08.02.2010 14:23

URL #127

Т.е. можно вообще без метанола, и вымачивать и переносить в этаноле?

smmuscle
Участник

08.02.2010 14:43

URL #128

Да, можно во всех операциях заменить метанол на этанол. Просто у буржуинов метанол дешевле, вот они и пишут в протоколах везде метанол.

svetodiodovna

14.02.2010 23:00

URL #129

Уважаемые коллеги, подскажите, пожалуйста. У меня сильно положительный белок (pI=11,25) и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану. Остальные белки:отрицательный контроль и маркеры переносятся. Может, кто подскажет, что добавить в буфер для переноса или в sample buff, чтобы поспособствовать переносу. Буфер для переноса использую трис-глициновый с 10%этанола.

guest: ммм
IP-штамп: frPZdWSNeN.0k
гость

15.02.2010 00:44

URL #130

-и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану.
1.Как вы это установили?
2. Какова масса белка? И процентность геля?
-что добавить в буфер для переноса или в sample buff
Может быть вам мембрану с другой стороны положить?

Добавьте 0.02% SDS в буфер для переноса. Но боюсь что причина не в том что он не переносится?

protein
Постоянный участник
Magyarország

15.02.2010 02:06

URL #131

а как вы определили что он не переносится? может проблема в антителах?

svetodiodovna

15.02.2010 14:01

URL #132

Антитела проверялись элайзой.
Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет, все остальное прокрашивается. Акриламидный гель после переноса крашу кумасси, мой белок четко виден, остальные не прокрашиваются (отрицательный контроль, маркеры)

Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.
В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло.

Хочу попробовать положить мембрану с двух сторон, тогда мой белок и маркеры с отрицательным контролем будут на разных мембранах.

smmuscle
Участник

15.02.2010 15:28

URL #133

Может, попробовать буфер для переноса приготовить с более щелочным рН, чем pI белка, или уж тогда действительно в другую сторону переносить без SDS

smmuscle
Участник

15.02.2010 15:35

URL #134

а вообще, странно

, если при электрофорезе он входит в гель, то почему же он не переносится тогда. Или у Вас форез какой-то экзотческий, не по Лэммли?

Сообщение было отредактировано smmuscle - 15.02.2010 15:35

guest: ммм
IP-штамп: frKx.BJzj62lY
гость

15.02.2010 17:11

URL #135

-Мембрану после переноса крашу ponceau red, моего белка нет.

Это ничего не значит, у понсо очень низкая чувствительность, раз в 10 меньше чем у кумаси. Те может оказаться что то что видит кумаси, понсо просто не видит.

-Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.
Должен вылетать на раз.

-В буфер для переноса пробовала добавлять SDS до концентрации 0,2%. Не помогло.

Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше.

1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе.

2) Добавте этанола в буфер и немного SDS и увеличьте ток или время переноса. Результаты должны улучшиться.

svetodiodovna

15.02.2010 21:40

URL #136

(smmuscle @ 15.02.2010 16:35)

а вообще, странно

, если при электрофорезе он входит в гель, то почему же он не переносится тогда. Или у Вас форез какой-то экзотческий, не по Лэммли?

Форез стандартный, если не ошибаюсь верхний и нижний гели содержат по 0,1%SDS, а running buffer - 0,4% SDS. Видимо, такого количества SDS хватает, чтобы белок приобрел отрицательный заряд и двигался в геле. Поэтому, в буфер для переноса я добавила SDS 0,2% (встречала в инете от 0,01 до 0,1%. Я добавила больше, чтобы наверняка, но как-то не помогло)

svetodiodovna

15.02.2010 21:50

URL #137

(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)

Мембрану красила амидовым черным, вроде, достаточно чувствительный краситель.

(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)

Так много SDS не имеет смысла(даже плохо) у вас белки начнут пролетать мимо мембраны в такой процентности SDS. Не надо грузить SDS больше 0.05%. Если хотите для маленького белка(22кДа) добавьте спирта до 20% будет получше.

Спасибо. Попробую такой вариант тоже.

(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)

1) Покрасьте белок антителами на мембране или кумасей(если вам не жалко блота, от кумаси потом практически не отмыться.) Просто что бы убедится, что все так плохо как вы думаете. Я думаю иначе.

Мембрану антителами проявляла. ECL работает точно.

svetodiodovna

15.02.2010 21:53

URL #138

(guest: ммм @ 15.02.2010 18:11)

увеличьте ток или время переноса. Результаты должны улучшиться.

Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока?

Daemonarchestratygos
Постоянный участник

15.02.2010 22:30

URL #139

(svetodiodovna)

У меня сильно положительный белок (pI=11,25) и он совсем не хочет переноситься на PVDF мембрану. Масса белка 22кДа, процентность акриламидного геля - 12%.

1) Есть такие маленькие (10-22 кДа), сильно оснОвные (pI 10.5-11) ядерные белки - гистоны. И с ними такой проблемы почему-то не возникает.

2) А чем нитроцеллюлоза хуже ПВДФ?

Сообщение было отредактировано Daemonarchestratygos - 15.02.2010 22:35

svetodiodovna

16.02.2010 10:43

URL #140

(Daemonarchestratygos @ 15.02.2010 23:30)

2) А чем нитроцеллюлоза хуже ПВДФ?

По-моему, эти мембраны ничем принципиальным не отличаются (или я ошибаюсь?)
Поэтому я работала над белком: подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е), sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf, кипятила,добавила сдс в буфер для переноса. Всеми этими манипуляциями я пыталась сдвинуть заряд белка в более отрицательную сторону и поспособствовать переносу.
Но если вы считаете, что нитроцеллюлоза поможет, я попробую.

Мне в принципе интересно, как работают с положительными белками? Я думала, что есть модификации классических методик. Или никаких особых манипуляций над ними не производят,а хватает обычного содержания сдс для придания отрицательного заряда?
Видимо, буду пробовать разные варианты, которые были предложены выше, и постараюсь победить этот белок упорством.

smmuscle
Участник

16.02.2010 11:26

URL #141

ПВДФ более гидрофобная, поэтому больше подходит для некоторых белков, они к ней лучше липнут. Только к ней, заразе, бывает, антитела тоже неспецифично липнут, поэтому фон иногда получается выше, чем на нитроцеллюлозе.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

16.02.2010 16:46

URL #142

-Мембрану антителами проявляла. ECL работает точно.
Как то странно вы отвечаете белок-то ваш покрасился или нет. Работоспособность ЕСL можно проверить вообще без блота.

-Гнала при 30мА ночь при +4 и 250-300мА в течение 2 часов. Этого достаточно или еще увеличить силу тока?

1) Совершенно бессмысленно это обсуждать без указания других параметров переноса

2) К тому же если сказано увеличить, то надо увеличивать просто, что бы проверить как это скажется на результате. Не существует никакой теории, которая предсказывает результат переноса по его параметрам. Существуют только эмпирические рекомендации.

А антитела то у вас работают вы не пробовали просто дот красить.

- подщелочила его до рН9 (вместо 4,5 в буфере Е)
Это еще что такое кислые буфера кодировки буквенные, непонятно,

-sample buf использовала с 9М мочевиной, добавила еще больше сдс в sample buf

Странно, у вас что белок сильно в осадке, мембранный? Зачем мочевина в сэмпле? Щелочной белок с pI больше 9 в 9М мочевине, не зависимо от количества SDS в пробе, рискует вообще вылететь из геля. Непонятно как он у вас в гель входит, может это и не он вовсе.

PerkinElmer

Moscow

26.10.2010 13:52

URL #143

Уважаемые коллеги!

Компания “Pribori Oy” предлагает большой выбор реагентов для проведения western blotting analysis (вестерн-блотинг анализа) производства американской фирмы “Perkin Elmer” для научных исследований, медицины и биотехнологии. Поставка продукции выполняется точно в срок со склада и под заказ. Высокое качество при умеренной цене!

С уважением, компания "Pribori Oy"

biooil

11.03.2011 22:30

URL #144

Подскажите может ли негативно повлиять на разгон белков в ПААГ добление поливинилпирролидона в лизирующий буффер?

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

11.03.2011 23:28

URL #145

-- Подскажите может ли негативно повлиять на разгон белков в ПААГ добление поливинилпирролидона в лизирующий буффер?

Не должОн.

biooil

14.03.2011 18:10

URL #146

Нужен более конкретный ответ, т.к. очень мало материала...

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

14.03.2011 18:30

URL #147

маркер прогоните с ПВП. Будет конкретный ответ.

DK.
Постоянный участник

02.07.2011 23:23

URL #148

Досточтимые коллеги, помогите, пожалуйста, "догнать прогресс"

Раньше ставил SDS-PAGE регулярно,когда работал с высокомолекулярными мембранными белками. Тогда заливал гели, в том числе градиентные, в основном сам (иногдa Bio-Rad) - а блоттинги проявлял ECL(Pierce), но в последний раз пришлось заниматься этим лет семь назад.
Сейчас опять возникла необходимость в блоттинге для другой задачи - но за это время появилось множество фирм, поставляющих готовые полиакриламидные гели для белкового SDS-фореза, да и с ECL реагентами большой выбор

. Памятуя, что но "умный учится на чужих ошибках, а дурак на своих"

, решил спросить вас - наверняка здесь многое перепробовано -из вашего опыта, готовые гели каких производителей наиболее достойны внимания по соотношению цена/качество?( это прежде всего экономия времени - или они еще и, действительно, лучше самодельных?)
Тот же вопрос по ECL: цена/чувствительность, поскольку искомые белки ( в диапозоне 25-50 кДа), предположительно, слабо экспрессированы.
Что посоветуете? - заказываться будет в Европе.

Tom1
Постоянный участник

03.07.2011 03:38

URL #149

1. для мини форезов так и остался "Био в рад" так выпускают и другие компашки, но обычно гели заточены под собственные камеры и с собственными буферами на классическим трис-глицином.
Что касаемо ЕСЛ то пользую 2 один " домашний" по прописи аналогичной выложенной тут в разделе методы люминол-кумариковая кислота и "фемто" от "Шивера" на случай совсем уж слабенького сигнала.
Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы)))

Поблагодарили (1): DK.

DK.
Постоянный участник

03.07.2011 11:08

URL #150

(Tom1 @ 03.07.2011 02:38)

Все енто касаемо реактивов в юсах, в европах чесно скажу не ведам гы-гы)))

- они все и по европам распластались уже

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.