Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Лигирование -- comments to a permanent page of the site --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Лигирование
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Guest
IP-штамп: frTlWdNmzlEpc
гость



 прочитанное сообщение 29.01.2007 16:38     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

тьфу, блин, вставка/вектор
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 04.02.2008 14:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

> Сильное ингибирование, если C>10µg/ml

Это связанно только с низкой концентрацией лигазы или есть еще причины?
Гость
IP-штамп: frsOY1KArVVno
гость



 прочитанное сообщение 18.04.2008 19:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

Привет всем! А у меня вообще жуткие проблемы с работой лигаз. Никогда прежде подобного не встречала: после трансформации вообще ни одной колонии. Причем эффективность самой трансформации завидная. Явно что-то сильно влиет на работу фермента, только не могу понять что?
GuestB
IP-штамп: frTITTs62W.JQ
гость



 прочитанное сообщение 07.08.2008 15:20     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Как проверить прошло ли лигирование?
Я лигирую кассету, затем лигирую ее в плазмиду.
Можно проверить форезом?
Или целесообразние ставить сразу второе лигирование, трансформировать и смотреть результат?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 07.08.2008 17:20     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

--Явно что-то сильно влиет на работу фермента, только не могу понять что?

Возможно(как один из вариантов) плохие липкие концы, если вы по ним лигируете. Те старый ПЦР или плохие рестриктазы.
25,65 ЕUR
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 21:02     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

"При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров)."

Использование слишком низких концентраций чего, вектора? Заранее спасибо за ответ.
путьведев
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 21:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

Логин 25,65 евро - неудачный. Надеюсь имя "путьведев" сработает. Вопрос выше.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 21:18     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

Ну что вы сами догодаться не можете?

Это ж очевидно вытекает из закона действия масс.

А второй ник страшен тем, что похож на спамбота.
спамбот
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 21:52     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

Я после нескольиких неудачных раундов лигирования уже в свою догадливость не верю. Очевидно, дефосфорилированный вектор самолигироваться не может. Конкатомер как я себе представляю образуется по схеме вектор-вставка-вектор-...-вставка-вектор-вставка (если разные сайты рестрикции). Чем больше /С/ вектора тем больше молекул конкурируют за свободый конец вставки. Так же вроде?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 22:17     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

--При лигировании существует оптимум концентраций вставки и вектора (использование слишком низких концентраций вызовет преимущественное самолигирование, слишком высоких - преимущественное образование конкатамеров).

Это написано не для дефосфорилированного вектора.

Дальше что.

Да, лигирование один из самых капризных шагов в клонировании и часто похож на алхимию.

Чего вы хотите. Эксперементируйте думайте и проверяйте все ваши реактивы в контрольных экспериментах. Главное не пытаться быстро и малой кровью получить результат за деньги или из какого-то волшебного протокола.
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.03.2009 22:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

(спамбот @ 24.03.2009 19:52)
Ссылка на исходное сообщение  Я после нескольиких неудачных раундов лигирования уже в свою догадливость не верю. Очевидно, дефосфорилированный вектор самолигироваться не может. Конкатомер как я себе представляю образуется по схеме вектор-вставка-вектор-...-вставка-вектор-вставка (если разные сайты рестрикции). Чем больше /С/ вектора тем больше молекул конкурируют за свободый конец вставки. Так же вроде?

вы, если хотите совета - лучше напишите сюда конкретно ваши условия реакции и сколько чего берёте - глядишь, и порекомендуют чего как улучшить.
спамбот
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 24.03.2009 22:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

2 mmm Спасибо. Ну вобщем я и думаю, вслух. У коллег на с тем же вектором все прекрасно получается. Судя по всему у меня что-то не так...

Блин... А ведь я судя по всему туплю - зачем я дефосфорилирую вектор, резаный по разным сайтам?

Не пытаюсь, денег нет, в волшебные протоколы не верю. Спасибо.

2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1
Участник оффлайн! comp3v
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 24.03.2009 22:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

(спамбот @ 24.03.2009 20:41)
Ссылка на исходное сообщение 2 comp3v Думаю условия много света не прольют. Вот они: вектор pEGFP-C3, вставка 1кb, XhoI Sal I. Протокол: рестрикция, дефосфорилирование вектора (я выше написал, видимо это необязательно), очистка на форезе, лигирование Fast T4 DNA ligase (Fermentas) 1час, 2 мкл лигазной смеси для трансформации, штамм ХL-1
Это ещё не протокол. Напишите, сколько чего берёте на лигирование - сколько вектора, сколько вставки, сколько лигазы.
Guest
IP-штамп: frD427Oiso1go
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2009 07:17     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

поставьте overnight или хотя бы с утреца на день. не верю я в эти все fast ligase, один вред от попыток сэкономить время таким образом.
Guest
IP-штамп: frD427Oiso1go
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2009 07:22     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

да, а главное - лучше не пытайтесь резать пцр-продукт, а залигируйте его в промежуточный вектор (по тупым концам или ТА), выделите плазмиду и вырежьте из неё свой фрагмент, а потом уже лигируйте. Так всё получится почти наверняка.
guest: 1
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2009 12:38     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

Спасибо Guest. C этой фаст-лигазой, вообще что-то странное, имхо. После неудачной трансформации, разогнал лигазную смесь на форезе - намного ниже 10 000 жирная полоса, и слаааабый шмер по всему интервалу вплоть до 1000 где-то. Я не очень понимаю как это интерпретировать.

Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом.
Участник оффлайн! e.coli
Участник
The Сатанів



 прочитанное сообщение 25.03.2009 16:17     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

Ligase binds DNA and will retard and spread gel bands when present along with the DNA. If you want to visualize ligation reaction results, you should heat kill the ligase (20 minutes at 65C) before running the gel. This works poorly for ligation reactions containing PEG such as virtually all "quick ligation" buffers. For cohesive end ligations, regular ligase works as well or better than those quick ligation buffers.

Отсюда: http://www.protocol-online.org/forums/inde...?showtopic=6964

По крайней мере частичное объяснение.
Guest
IP-штамп: frD427Oiso1go
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2009 18:10     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

(guest: 1 @ 25.03.2009 11:38)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо Guest. C этой фаст-лигазой, вообще что-то странное, имхо. После неудачной трансформации, разогнал лигазную смесь на форезе - намного ниже 10 000 жирная полоса, и слаааабый шмер по всему интервалу вплоть до 1000 где-то. Я не очень понимаю как это интерпретировать.

Моя коллега так и делает - лигирует в pJet по тупым концам, потом режет и потом лигирует в pGFP Я решил время сэкономить. Ну и по моим представлениям все должно получаться и с пцр-продуктом.

ну это оно должно. Но часто не работает. Насчёт лигаз - я пользуюсь промеговской лигазой в fast ligation буфере (2х который), но ставлю не на два часа, а на ночь или часов на 6. Всё лигируется.
guest: 1
IP-штамп: frCCxagoxzeik
гость



 прочитанное сообщение 26.03.2009 13:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

Поставил на ночь, в pJET сегодня попробую трансформировать. Завтра узнаю что и как.
Guest
IP-штамп: frD427Oiso1go
гость



 прочитанное сообщение 28.03.2009 09:20     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

расскажите потом! а то все пишут, когда у них что-то не получается, а об удачных экспериментах молчат. А это зря.
Участник оффлайн! Miss Marple
Участник
Москва vs. Европа



 прочитанное сообщение 23.09.2009 14:30     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

Добрый день!
После лигирования получили 1-2 колонии на чашку - что есть мало. Пожалуйста, подскажите, что не так.
(Пропись использовали и раньше с другой линейной ДНК, получали в среднем 20 колоний на чашку.)
ПЦР-или плазмиду 5,5кб, убирая её "кусок" ПЦРом. На 5прайм конце праймеров - половинки добавочного сайта рестрикции.
Судя по гелю, выход продукта ПЦР где-то 1 микрограмм. После очистки - 40нг/мкл.

Phosphorilation:
30mkl DNA (40ng/mkl, purified from gel PCR product of full lenth plasmid)
1,5mkl 50mM ATP
1mkl PNK Fermentas
3,6mkl PNK buffer A
90'37C
10'70C

Ligation:
1mkl T4 DNA Ligase (NEB)
5mkl T4 ligase buffer
5mkl PEG 4000 50%
16mkl linear phosphorilated DNA
23mkl H2O
1h room temperature

Transformation DH5alfa
Трансформируется вся лигазная смесь полностью. Потом все полностью расторается по чашке.
Есть подозрение, что фосфатаза не сработала. Как проверить, какие контроли поставить?
guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость



 прочитанное сообщение 24.09.2009 08:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

Есть подозрение, что фосфатаза не сработала.
Есть подозрения что не очень эффективная трансформация или лигирование.
Участник оффлайн! Miss Marple
Участник
Москва vs. Европа



 прочитанное сообщение 24.09.2009 12:52     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

(guest: ммм @ 24.09.2009 07:56)
Ссылка на исходное сообщение  
Есть подозрения что не очень эффективная трансформация или лигирование.



Трнасформация стандартная, как всегда (30 минут на льду без теплового шока), клетки высококомпетентные - 50нг контрольной плазмиды дают 30-50 колоний на чашку (по-другому компетентность не проверялась и не пассчитывалась).
Пробовала вчера ставить лигирование по-другому:
12 мкл Вода
5мкл фрагмент ДНК 35нг/мкл (фосфорилировала более свежей фосфокиназой)
2мкл Буфер
1мкл фермент (НЕБ)

В 20мкл, 2 часа на столе - как указано в брошюре для фермента (также без добавления ПЕГ).
Итог - ноль колоний. confused.gif
guest: ммм
IP-штамп: frCNCa5alkkCM
гость



 прочитанное сообщение 24.09.2009 13:03     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #74 множественное цитирование

-рнасформация стандартная, как всегда (30 минут на льду без теплового шока), клетки высококомпетентные - 50нг контрольной плазмиды дают 30-50 колоний на чашку (по-другому компетентность не проверялась и не пассчитывалась).

Вы этот +контроль, вчера ставили?

Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.
Участник оффлайн! Miss Marple
Участник
Москва vs. Европа



 прочитанное сообщение 24.09.2009 15:10     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #75 множественное цитирование

(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03)

Вы этот +контроль, вчера ставили?

Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.

50 нг плазмиды как положительный контроль - дали (не считала), но на глаз - где-то под сотню колоний.
Контроли без лигирования тоже ставлю: 100нг линейной фосфорилированной ДНКи (ноль колоний, в том числе когда при лигировании было 1-2 колонии на чашку). Что еще не учла? какие еще контроли?
Участник оффлайн! Miss Marple
Участник
Москва vs. Европа



 прочитанное сообщение 30.09.2009 14:56     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #76 множественное цитирование

(guest: ммм @ 24.09.2009 12:03)

Вы этот +контроль, вчера ставили?

Я ничего не могу вам сказать. только вы почему то очень свято верите в то что у вас все работает. А проверкой этого не занимаетесь.


Просто в качестве апдейта:
Коснструкт "сработал" из одного клона и был пущен на дальнейшее клонирование вставки по двум сайтам рестрикции. На рестрикцию было взято 3мкг плазмиды, но на этот раз фрагмент вырезался под 366нм УФ, а фотографировались "дырки" на геле. Продукт элюировлся в 30мкл буфера и 10мкл было взято на лигирование. Итог - несколько сотен колоний на чашку. Практика фотографирования "дырок" взята на заметку....
Guest
IP-штамп: frMsTDflcGfck
гость



 прочитанное сообщение 12.12.2009 00:26     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #77 множественное цитирование

Как лучше чистить лигазную смесь для электропорации? Или можно вооще не чистить? Переосаждать что-то не хочется - слишком маленькие количества, потеряется всё. Можно ли китами для очистки пцр-продукта?
плазмиды 3-15 кб.
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.12.2009 22:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #78 множественное цитирование

китами тоже потеряете. Возьмите 1 мкл из лигазной реакции per se на 50 мкл клеток, 5мсек, конечно, не будет, но 4,0-4,4 получится. Сойдет
Guest
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость



 прочитанное сообщение 14.12.2009 18:12     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #79 множественное цитирование

говорят, так электропоратор сломать можно, если не чистить confused.gif eek.gif redface.gif
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.12.2009 18:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #80 множественное цитирование

полный бред, не надо путать с плохим бензином в бензобаке
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 09.03.2010 12:02     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #81 множественное цитирование

Подскажите, пожалуйста, в чем м.б. причина отсутствия колоний (осенью получала 20 на чашку)?
ПЦР продукт 955 п.о. выделен электрофорезом, почищен нашим набором "БиоСилика"
Лигирую в pGEM-Tvectot или Т-easy ON во льду в соотношении 1:1,5

2х буфер 5мкл
лигаза 1мкл
вектор 0,6мкл
вставка 2мкл
вода 1,4мкл

Электропорация
2мкл лигазной смеси в 60 мкл комп. клеток (10^8 на pUC19)DH5alpha
импульс 5мс (1.8кВ, 1мм кюветы)
хот.шок 47С в LB бульон (МgCl2,Glc)
инкубация на 37С 1 час
Рассев 200мкл на чашку LB агар 2% (Amp200, X-Gal, IPTG)
37С ON
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.03.2010 12:26     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #82 множественное цитирование

а зачем и порация, и хотшок? Это новации в клонировании такие? Либо одно (42, а не 47-на секундочку!), либо другое. Если не растет, проверьте лигазу
Участник оффлайн! protein
Постоянный участник
Magyarország



 прочитанное сообщение 09.03.2010 15:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #83 множественное цитирование

лигаза чья? если ферментас, то это много очень, там хватает 0.4 мкл на 20 мкл лигазной смеси. и послушайте Дио, делайте хеат шок 42, 30-60 сек.
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.03.2010 17:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #84 множественное цитирование

да, похоже на проблему с лигазой. чтоб вообще ничего не росло- надо постараться
Участник оффлайн! protein
Постоянный участник
Magyarország



 прочитанное сообщение 09.03.2010 17:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #85 множественное цитирование

(nifloW @ 09.03.2010 14:02)
Ссылка на исходное сообщение  
Лигирую в пГЕМ-Твецтот или Т-еасы ОН во льду в соотношении 1:1,5

и соотношение подправьте, сделайте 1:3-5
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.03.2010 19:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #86 множественное цитирование

да не важно, хоть 1:10, влияет только на кол-во рекомбинантов и имеет значение для клонирования библиотек. с фрагментом не будет проблем.
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 10.03.2010 08:23     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #87 множественное цитирование

Спасибо за советы. Скажите, а как лигазу проверить? Лигаза Promega из набора вместе с вектором и буфером. Методику ставила не я, поэтому для чего и электропорация и хотшок не знаю. Проблема в том что раньше все работало. Дело именно в лигировании, т.к. контроль с pUC19 растет прекрасно. А с лигазной смесью нет даже синих колоний. Вчера поставила на +15 лигирование 2.5 часа, запорировала. В итоге из 4х лиг. смесей, только на одной чашке одна колония.
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.03.2010 13:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #88 множественное цитирование

возьмите любую др. лигазу, сравните
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 11.03.2010 08:28     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #89 множественное цитирование

Дело в том, что я делала с лигазой для pGEM-T-easy и с лигазой для pGEM-T vector-ров. Можно ли считать это контролем с др. лигазой?
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.03.2010 12:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #90 множественное цитирование

лигаза и в Африке лигаза. Думаете, Промега делает 2 (3, 4 и тп) разные лигазы для разных китов? так не бывает
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 12.03.2010 07:21     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #91 множественное цитирование

Логично... не подумала.
Проверила с другой лигазой. Поставила ПЦР+форез

SP6 1.9
T7 2
dNTP 0.8
MgCl2 2
TagPol 0.7
C1 буфер 2
H2O 8.6

2мкл лигазной смеси

1. 94с 1мин30
2. 94с 25сек
60С 15с
72С 1м40
3. 72С 4м
4. 4С

в 1% агарозе

Итог - дорожки пусты, только маркер. Ставила с новой лигазой, не из наборов для вектора, как со старым буфером так и с новым, с ATP и без (того 4 дорожки не считая контроля и маркера).
Ранее так же гоняла два набора векторов с их лигазами (+ доп контроли без лигаз) - дорожки пусты.

Сообщение было отредактировано nifloW - 12.03.2010 07:24
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.03.2010 11:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #92 множественное цитирование

во-первых, что вы хотели проверить ПЦР? Слигировалось или нет? ОК, а сколько циклов поставили. надо хорошенько считать циклы, исходя из кол-ва вектора в лигировании в приближении, что не более 1% материи представляет собой аплифицибельный ампликон, то есть еще уиклов 7 добавьте. Да и возьмите в голову, что комбинация праймеров T7 -SP6 очень плоха, SP6 вообще крайне мягкий и плохой в ПЦР праймер. Возьмите вместо него сиквенс-специфический реверс
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 14.03.2010 08:53     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #93 множественное цитирование

Да, хотела проверить идет ли лигирование. Ставила 35 циклов. Вектора 0.6мкл (50нг/мкл) в 10 мкл лиг смеси - из нее брала 2мкл для ПЦР. Специфический реверс -для той вставки которыю лигирую, подобранный мной?
Спасибо за советы!
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 14.03.2010 18:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #94 множественное цитирование

можно и так, но я никогда так не делал- а зачем, либо растет после трансформации, либо нет, а от того, что ПЦР имеется, клонов не станет больше
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 15.03.2010 07:34     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #95 множественное цитирование

Я просто уже не знаю, что же не так и почему не растут клоны( Однако и ПЦР ничего не прояснила.
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.03.2010 12:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #96 множественное цитирование

во-во. и не прояснит. Надо копать дальше, вопросы будем обсуждать.
Участник оффлайн! nifloW




 прочитанное сообщение 16.03.2010 07:31     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #97 множественное цитирование

Все оказалось просто... и глупо - неправильно подсчитана компетентность клеток. Не 10в8, а 10в6. Так что чистые чашки вполне закономерны(((
Участник оффлайн! velekap




 прочитанное сообщение 16.05.2014 10:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #98 множественное цитирование

Подскажите, кто-нибудь ставил лигирование Т4 лигазой на выходные при +4 или RT?
Участник оффлайн! Epsilon

Новосибирск



 прочитанное сообщение 16.05.2014 14:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #99 множественное цитирование

Да, регулярно ставлю и на 16 часов, и на 24, и на пару дней. Обычно от 10 мкл лигазной реакции беру на трансформацию 3 мкл и если результат трансформации не устраивает, то её можно повторить на следующий день, а лигазная смесь всё это время стоит на +4 и с ней всё в порядке. Использую T4 ligase от Promega.
Участник оффлайн! R.J.Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.05.2014 18:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

ставьте на 5 мин, что за проблема, ПЭг- и вперед, только следите за качеством реактивов

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 17:15
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft