Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
|
Гость IP-штамп: frYFKPXNgytn6 гость |
|
Baudelaire Постоянный участник где только можно |
|
Гость IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
Или просто потом отфенолить смесь вместо фореза |
Гость IP-штамп: fri2vAOvq/RMI гость |
|
гость: Г IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
|
Guest IP-штамп: fr3PpYUagJAXg гость |
можно |
spopov |
|
Гость IP-штамп: frlnAsDr.5x7A гость |
|
Gost'A IP-штамп: frFGmKG96xW02 гость |
подскажите плеасе, как бы по-ловчее сшить ПЦРом несколько ПЦР-продуктов? Спасибо!
|
Alder Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Anna P. Участник |
Расскажите, пожалуйста! |
curious67 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано curious67 - 19.07.2006 16:57 |
curious67 Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано curious67 - 19.07.2006 16:57 |
Guest IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
Скажите, а в повторении каждого сообщения по три раза есть какой-то скрытый смысл или это у вас случайно получается? |
curious67 Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано curious67 - 19.07.2006 16:59 |
Anna P. Участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: frPEUtqlG0HEg гость |
Anybody can write a detailed protocol for short oligos cloning? 1) Annealing: buffer/concentrations(oligos already with 5'p grope 2) for ~50ng of dephosphorilated vector how march I should use annealed duplex? 3) any difference in time of ligation comparing to what ligase protocol say |
Gost'A IP-штамп: frFGmKG96xW02 гость |
Спасибо!
|
Atropos Постоянный участник abroad |
(Gost'A @ 17.07.2006 17:50) Есть ещё
|
comp3v Постоянный участник Москва |
(Atropos @ 22.10.2006 23:25) но там, как я понял, придётся вместо двух ПЦР + одного лигирования ставить одну ПЦР + два лигирования, так? |
Atropos Постоянный участник abroad |
|
curious67 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Atropos Постоянный участник abroad |
Силекс пишет: "Для улучшения результатов трансформации, мы рекомендуем инактивировать лигазу прогреванием при 65 oC в течении 10-15 мин. Выход трансформантов существенно улучшается (выход может увеличиться в 100 раз)." А Roche: "Heat inactivation should only be done if the ligation reaction mixture is used in experiments other than transformation assays. Otherwise, a drastic decrease of (> factor 20) transformants is possible." Интересно, кто же прав? |
curious67 Постоянный участник |
|
comp3v Постоянный участник Москва |
|
klav Постоянный участник Москва |
|
curious67 Постоянный участник |
|
guestA Постоянный участник |
(curious67 @ 02.11.2006 13:48) перед электропорацией я просто переосаждаю- этого достаточно, потерь нет, при экстракции %10 потеряете по любому. Да, экстрагировать -- теряется, увы, да и лениво... А я даже не переосаждаю лигирование, а просто беру мало-мало или развожу водичкой. Нормально трансформируется. |
comp3v Постоянный участник Москва |
Я обычно беру на трансформацию 3-4 мкл из 20 мкл лигазной смеси (не разводя) - наверное, это даже много? |
guestA Постоянный участник |
(comp3v @ 02.11.2006 17:39) А во сколько Вы разводите? Я обычно беру на трансформацию 3-4 мкл из 20 мкл лигазной смеси (не разводя) - наверное, это даже много? Мне кажется, 3-4мкл лигазной смеси -- это много для электропорации, потому что вносится много солей, и раствор с клетками будет обладать значительной проводимостью. Я ставлю лигирование в 10мкл, на трансформацию беру 0.5мкл. Можно брать еще меньше: если взять тооонкий носик и в него набрать столько, что глазами еще видно, а меньше взять уже не получается. Это я называю мало-мало. Или развожу 1мкл лигирования в 10 раз и беру 1мкл из разведения. Оставшуюся смесь замораживаю, чтобы если что, можно было повторить. Перед трансформацией обычно инактивирую лигазу нагреванием на 65 град. 15 минут. Впрочем, иногда забываю инактивировать, и пока не заметила разницы в эффективности. |
curious67 Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: frpJm54klq.ac гость |
|
Гость IP-штамп: frpJm54klq.ac гость |
|
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
(Гость @ 29.01.2007 09:14) какое всё-таки молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент нужно брать. в одних методиках написано(к примеру Weiss B.) "Молярное соотношение вектор : клонируемый фрагмент 1:3", в других - наоборот 3:1, 5:1. зависит от размера вставки |
Гость IP-штамп: frpJm54klq.ac гость |
|
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
|
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
(нг вектора х кб вставки/кб вектор) х молярное соотношение = нг вставки это из мануала к ТА киту. Там же сказано, что в общем случае успешны бывают соотношения от 1:3 до 3:1 |
Гость IP-штамп: frpJm54klq.ac гость |
|
Guest IP-штамп: froCfVMLWiGRs гость |
(Guest @ 29.01.2007 11:32) ага, вот еще формулка от Промеги: (нг вектора х кб вставки/кб вектор) х молярное соотношение = нг вставки это из мануала к ТА киту. Там же сказано, что в общем случае успешны бывают соотношения от 1:3 до 3:1 А молярное соотношение чего к чему? |
Guest IP-штамп: frTlWdNmzlEpc гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |