Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Самый удобный метод выделения DNA из геля. Он дёшев, позволяет выделить фрагменты DNA любого размера с эффективностью более 90%, очень быстр, позволяет выделить одновременно так много фрагментов, как много лунок вы вырежете. Выделенную ДНК без дальнейшей очистки можно использовать для лигирования, кинирования, реакции Random Primer, рестрикции. |
_Артем_ IP-штамп: frftLGqhpFF.A гость |
При концентрации PEG 17% можно не пользоваться фитилями, так как раствор довольно вязкость и при аккуратном наслоении остается таковым при ЭФ. Вязкость PEG сильно зависит от температуры и при необходимости ЭФ можно проводить при пониженной температуре. |
Atropos Постоянный участник abroad |
|
Guest IP-штамп: fr9kBRMm7UODU гость |
|
Guest IP-штамп: fr9kBRMm7UODU гость |
И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов. Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Biotechnique, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?! |
Platov |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 04.11.2006 09:30) метод элюции из геля , описанный выше а) трудоемок крайне б) грязен в смысле кросс-контаминации при выделении более 1 фрагмента в параллель в) с трудом справляется с разделением и элюцией одной из дву-трех близко идущих полос И потом, оценка повреждения ДНК при облучении зависит, кроме длины волны и размера фрагмента, еще и от времени облучения, расстояния от лампы до геля и тп- что очевидно, не сам свет плох, а количество поглощенных фотонов. Ну и про последнюю статью- смешно, как 99% всего, что сливается в Биотечнияуе, ей-богу. МОжно много чего налить в буфер (как в бензин!)- может, просто научиться работать быстро , чисто и не повреждать ДНК ультрафиолетом, а мозги- чтением бредовых методик и статей?! А можно работать МЕДЛЕННО И не суетиться зазря И не ОБЛУЧАТь ДНК улътрафиолетом сдуру |
mega monster kill Monster City |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(curious67 @ 16.12.2006 22:51) а зачем тогда киты для выделения из геля? А куды деваться от кусков (маленькие- но все же) агарозы- она отлично ингибирует все подряд, начиная с лигирования из агарозы естъ КлонВелл - НИЧЕГО ВЫРЕЗАТь НЕ НАДО |
Alexkiev |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Alexkiev @ 23.07.2007 12:55) мега_монстер_килл, а каими последствиями чреват такой метод? для чего замораживать гель с ДНК, разрушить? ДНК выходит через гель с ТБЕ? Как потом будут вести себя рестриктазы в этом буффере? тут полоска приходит в ЛУНКУ с ВОДОЙ когда видищ что уже продукт подошел к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ |
Alexkiev |
к лунке в геле - Просто добавь ВОДЫ Вариант неплохой, но прибор... Все равно спасибо, подкоплю денег и... Как лучше выделить днк 200п.н. из геля для последующей амплификации...? Скорее всего малая концентрация. Спасибо |
Alexkiev |
Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Alexkiev @ 27.07.2007 12:47) Вопрос 1: Может ли в реакции сильнее амплифицироваться плазмида, чем нужная вставка?? Вопрос 2: Кстати, знает ли кто-нибудь можно ли полученный продукт из ПЦР, точнее всю смесь после реакции ПЦР (уже полученная вставка, с конц. 1нг в 1 мкл, праймеры, нуклеот., полимераза, вода...), разделить на двое (по 25мкл) и довести оба эппендорфа до 50 мкл, добавив dNTP, праймеры, полимеразу... и запустить реакцию по новой, тем самым обезвредив концентрацию пирофосфатов... и в результате получить больше нужного продукта? ПЦР не дает внушительного количества. Спасибо Ваши ближайшие цели? Иначе быть пожару на Вашем рабочем месте. Я мею ввиду пожар в виде контаминации ПЦР продуктом. . |
Alexkiev |
|
Ъ IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg гость |
(Alexkiev @ 30.07.2007 11:06) Да насчет ПЦР, это просто интерес, слишком мало продукта получилось из вставки, хотя саму вставку до реакции на форезе вообще видно не было. Вставка была около 1нг в 1мкл... Нет смысла элюировать из геля, да и другими способами, больше потеряю чем выделю. А вот по поводу амплификации плазмиды, а не вставки, это серьезно. Я уже решил порезать ее и использовать кусок со вставкой для амплификации, а не целую. Что думаете? Если у Вас выход ПЦР продукта низкий, это не по причине что Вы взяли в качестве матрицы вставку (это ПЦР продукт?) или плазмиду. Для ПЦР эти количества матриц практически одно и то же. Теоретически, линейка-плазмида лучшая матрица, но проблема Ваша в самой ПЦР - низкий выход из-за плохо оптимизированной смеси. Оставьте плазмиду и вставку в покое и ищите причину в другом, начиная со структуры праймкров (нет ли ошибок). Происхождение Ваших реактивов и, вторично, Ваши ближайшие цели? |
guеst IP-штамп: frlP9jDcX5Elk гость |
(Alexkiev @ 27.07.2007 11:47) Может, если перебухать фермента и поставить неоправданно большое время элонгации (минуты две). Вы ничего не написали о вашей амплификации. На основании такой информации никто Вам помочь не сможет. Если наугад, то чаще всего "низкий выход" получается, когда людям требуется амплифицировать сравнительно короткий фагмент, но они берут "обычную" концентрацию праймеров. |
Alexkiev |
Кстати насчет перебуха - верно, но после нескольких казусов в таком состоянии на работу не прихожу |
Ъ IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg гость |
Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. |
Guest IP-штамп: fr1UUj0STsybI гость |
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. Сегодня около Венеции- погода дер;мо- рву -Миласн-Генуя |
Guest IP-штамп: fr1UUj0STsybI гость |
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. Привет Ты еше не охерел |
Guest IP-штамп: fr1UUj0STsybI гость |
(Ъ @ 03.08.2007 15:57) Меня смущает низкая температура отжига при такой высокой темп. плавления праймеров. Можете ли выставить праймеры и расписать точный состав ПЦР смеси, соблюдаете ли "горячий старт"? Вносите миллионы копий матрицы (нг вставки или плазмиды!) в реакцию и низкий выход ПЦР продукта - это надо уметь. НУ ИЗВИНИ - из италии приходится мессаги кидат завтра рвану на другой берег |
Ъ IP-штамп: frh5mdI9nB8Yg гость |
(Guest @ 03.08.2007 17:34) Я думал, что ты давно загораешь. Привет. А я уже загораю на том же месте, где и был на майских, на острове в Средиземном. Это к юго-востоку от тебя. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |