Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Параметры PCR реакции: предварительный нагрев; количество циклов; температуры и время денатурации, отжига и элонгации. Пост-PCR. Удаление масла после PCR. |
guest: Гость IP-штамп: frHVRS/ao5Sko гость |
|
miniopticon IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
сначала рисуют "быстрые " температурные переходы и учут - если быстро с 44 нагреть до 72 - то праймер свалится потом пишут что активностъ Так полимеразы при 37 - 1.5 нуклеотида в секунду то есть ПРАЙМЕР уж ТОЧНО протянулся при 44 и не должен СВАЛИТСЯ |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
то переноси с циклера на циклер и программу не меняй ну-ну АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера! так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ что пцритъ бросиш навек |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Guest @ 02.01.2007 13:55) еще одно "интересное" утверждение - если пробирка например 0.2 мл то переноси с циклера на циклер и программу не меняй ну-ну АБИ например работают тока в КАЛКУЛАТЕД ТУБЕ КОНТРОЛ то естъ ТАЙМЕР вклучается по температуре СМЕСИ а БИОМЕТРА - толъко по БЛОК КОНТРОЛ и разница может бытъ 20 градусов в момент вклучения таймера! так напереносишся с АБИ на БИОМЕТРУ что пцритъ бросиш навек а если Примусов поимееш - то ПЦРитъ не начнешь ))))))))) |
Гость IP-штамп: frMBK77sTX3LI гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 14.01.2008 18:31) Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом.... Если все семь букв GC, есть риск вляпаться. Однако, если реакция оптимизирована, проблемы с димеризацией может не будет. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 14.01.2008 18:31) Вопрос от не-биохимика: есть подозрение, что в нашей реакции образуются димеры праймеров (программка предсказывает довольно длинный участок димеризации - более 7-ми нуклеотидов, точно не помню); как я могу проверить, есть у меня димеры или нет? вВ противном случае, будем искать проблему в другом.... Программа может возмущаться и отбраковать праймеры, но это не значит, что они плохие. Повторюсь, все зависит от того как все у Вас налажено в реакции - реактивы, циклер (циклер немаловажно, иначе от Гостя1 наслушаетесь такой критики ). 7 букв по всему праймеру (если не CG и не подряд) - это обычное дело. А если 3-штрих конец торчит при этом, это даже хорошо. |
Гость IP-штамп: frMBK77sTX3LI гость |
Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Гость @ 15.01.2008 11:20) Спасибо за ответ. Да, реакция была оптимизирована и использовалась в нашей группе не менее 4-х лет (LCR-reaction, plasmid 3,6 kb). Но в руках нового человека с новыми праймерами она перестала работать вообще, даже со старыми "работавшими всегда" праймерами получили только по 1-3 колонии на чашку. Я ломаю голову, что же еще может быть причиной. Нет, не все Г-Ц подряд. Использовали разные полимеразы, разные оптимизированные протоколы для разных полимераз. When your PCR is shaky, a lot of hands-to hands pecularities become important. Among these, I would check the following: 1. How reagents are mixed and kept, on ice or at RT? Adding primers on ice and keeping Master Mix on ice promotes primer-dimers. 2. How long it takes to actually start PCR after the plate/tubes is ready? The longer you keep, the more P-D's you will get. 3. Avoid old primer stocks. Also, whenever you can, even if you use hot-start polymerase, use "false hot start" method. I e, heat the block to 94 and only then place your plate into the block. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Гость IP-штамп: fr0CXODQM332o гость |
* концентрации праймеров; * концентрации соли. Я обычно использую онлайн-инструмент |
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
(Гость @ 28.11.2008 16:02) >Хотим обратить внимание начинающих пользователей компьютерных программ, что хорошие программы требуют для определения Tm задания двух параметров: * концентрации праймеров; * концентрации соли. Я обычно использую онлайн-инструмент Халявная программа с дружественным предложением: синтезируйте олиги у нас! DNAstar и DNAsis надо покупать, и не за малые деньги. Но те не занимаются синтезом олигов. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |