привет..
нужен western-blot, белок большой (320kDa) и основной, не переносится на мембрану после фореза - и все тут..пробовалa CAPS-buffer, но я не спец по westernam..пожалуйста, подскажите кто делал-знает..

1. какой процент акриламид.
2. буфер с метанолом без???
3. гель перед переносом замачивали?
4. условия переноса... типа ток время...

[Текст переведён с транслита]

спасибо за скорую помощь..
аа-5%
methanol-1%
-имеете ввиду-прополоскть гель в буфере переноса перед сэндвичем?
-время пробовала от 1 часа (150V), 2h (100V), 3h (50V), overnight (20V)

Имхо
1. метанол до 30%
2.гел пополоскать в буфере 1час.
3.я не понимаю что такое 150в...
сколько миллиампер было???
Имхо надо поробовать 40миллиампер ночь....

[Текст переведён с транслита]

да не перенесья на мембране не было а в геле остался или как??
если в геле не было положить мемрану с двух сторон....

[Текст переведён с транслита]

1. Да, про силу тока все верно, ориентироваться надо по милиамперам.

2. ...имеете ввиду-прополоскть гель в буфере переноса перед сэндвичем? - Да.

3. Покрасьте гель кумаси после переноса- посмотрите, где белок.

Мокрыи перенос не пробовали? У нас в лабе так и более крупные белки переносили. Хотя, конечно, от конкретного белка зависит.

[Текст переведён с транслита]

А почему надо ориентироваться по миллиамперам?

Привет.
Переносил я 300кДа белок. Пробовали мокрый перенос-переносился белок, но плохо. Поэтому сделали просто агарозный форез и затем капиллярный вестерн. Получилось отлично.
Если хотите узнать методу подробнее, могу скинуть на мыло.

кинь мне тоже ....

[Текст переведён с транслита]

Наверное, сейчас глупость скажу Вот кто-нибудь мне объяснит, зачем с такими здоровыми объектами работать? Их нельзя подоменно изучать что ли? Ну если это не новый неизвестный белок конечно. Нарезал, допустим, 300 на 6 доменов, ну или как получится, и изучай их на здоровье. Если надо, комбинируй. Вряд ли для проявления какой-бы то ни было активности нужны 300 кДа.

Vadim, a можно мне тоже Ваш протокол? Мой адрес: mesentsev@yahoo.com

Для Kokava: Так, ведь, мощность у разных источников разная.

Я извиняюсь, а при чем тут мощность? По-моему, сила тока определяется буфером для переноса, другое дело, что она, видимо, должна быть постоянной, вот не помню, сильно ли она меняется во время электроблоттинга. А мощность определяет максимум напряжения х ток, который прибор может дать. Да,нет?

Дети мои! Вы меня удивляете... Одному вольты не нра, другой кажется, что ток определяется буфером. Физику забыли, типа закон Ома? На самом деле для РАЗНЫХ камер - разные условия. Можно говорит о напряженности электрического тока (V/m) и плотности тока (A/m²). Наиболее корректный параметр - мощность, но, опять же только при схожих геометрических параметрах камеры/электродов/буфера для переноса. Предлагаю пальцы не гнуть, а например, говорить о НАПРЯЖЕНИИ для камеры у которой между электродами, скажем 12 см, или о силе тока, если площадь мембраны - 100 см².
А потом сказать: вот для этих условий достаточно 3 часа и белок (66 скажем kDa) переносится на 80% из геля...

Владим, буду рада если напишешь про агарозний гель, попробую..
"Гостье": дело в том, что у нас fusion белок, продукт транслокации 4 и 11 хромосом, которий деплетируем siRNA, воопшем необходим вестерн на весь продукт..
в остальном, у нас обычние биорадовские камеры, белок остается в геле, мембрану крашу Ponseau (или как она там пишется)-там максимум маркер-240кДа, выше ничего нет и воопше все плохо..
А про силу тока спасибо..

[Текст переведён с транслита]

to Vladim
а можно и мне методу
evlachev@cervi-lyon.inserm.fr
спасибо большое

Есть метод для бол'ших белков:
50 мМ CAPS, pH 11.1, 50 мМ NaOH; в холоднои комнате при постоянном токе в 400 mA, 1 час. Перед переносом гель и мембрану, ес-но, уравновесить в CAPSe, ок. 30 мин.

Удачи!

[Текст переведён с транслита]

Уважаемыи Vadim
Не могли бы вы и мне вислать ваш protocol?
ol_che@yahoo.fr
Заранее спасибо

и мне, пожалуйста

[Текст переведён с транслита]

У меня белок 350 кДа
переношу в 12 мМ Трис, 96 мМ Глы, 20% Метанол
720 мин при 20В (силу тока не помню)
Правда мой белок кислий

[Текст переведён с транслита]

Для arkhipkina:

Для переноса белков с большого геля я готовлю 4 литра CAPSa: берем 8.88 г сухого порошка и растворяем его в 3 литрах воды. Далее доводим pH, например, до 11,2, доливаем воды до 3,2 литра и доводим объем метанолом до 4 литров (20% метанол). Далее, примерно в пол литровом- литровом корыте собираем sandwich. В другой порции (примерно 100- 200 мл) замачиваем гель. Примерно такой же объем пойдет на промывку мембраны. Остальное- на перенос (ячейка, подлить немного в tray с сэндвичем плюс если что прольется, опять-таки). Где-то, пол литра- литр буфера остается: можно вылить, а можно оставить на следующий день.

Перенос: холодная комната, час минимум, сила тока на Bio-Rad'овской большой ячейке ~450-500 mA. Делать transfer надо с охлаждением. Я ставлю ячейку в пенопластовый box, сам ящик- на магнитную мешалку. В box насыпаю льда. В принципе, при хорошей скорости мешалки, у меня проблем пока не было. Льда можно подложить через пол часа еще.

Думаю, должно сработать и для Вашего белка тоже.

Чем БОЛЬШЕ белок, тем МЕНЬШЕ % метанола.

Объясните, пожалуйста, почему?

One reason for a dusty home is that you might สล็อต123 not be washing your sheets often enough. Remember หวย that bedding is where your dead คาสิโนออนไลน์ skin cells shed, and this creates a prime baccarat environment for dust mites. When cleaning ลิงค์รับทรัพย์ your bedroom you want to wash your bedsheets เว็บสล็อต and pillowcases at least once a week. If you have pets, ทดลองเล่นpg you may want to wash your sheets more often, such สล็อต เครดิตฟรี 30 ไม่ต้องฝากก่อน ไม่ต้องแชร์ ยืนยันเบอร์โทรศัพท์ as every 3 or 4 days. If you have allergies สล็อตเว็บตรง แตกง่าย ไม่มี ขั้นต่ำ or asthma, try washing your sheets more often to see if you get Nigoal any improvement in your symptoms.

One of the most crucial traits of organized people พนันออนไลน์ is that they know what they สล็อตออนไลน์ have to do and when, plus how much time they need คาสิโนออนไลน์ to do it. If you know what you have to do, แทงบอลออนไลน์ but you’re not sure how long this task will take หวยออนไลน์ you, you should do what organized people do to 123GOAL track the time you spend on your daily 123BET activities. Thus, you’ll gain a clearer understanding of what your jokerslot day looks like and whether you need to change some joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก habits. So, being able to organize your tasks and activities will help ทางเข้าnigoal you manage your time more effectively.

Our lives are so hectic, and finding healthy พนันออนไลน์ foods that everyone in your สล็อตออนไลน์ family will actually eat is super challenging. If you’re at คาสิโนออนไลน์ a point where you too feel like you need แทงบอลออนไลน์ to make some changes, it canหวยออนไลน์ be tough to know what 123GOAL to do first. Here are some simple 123BET healthy habits that you can jokerslot add to your life that won’t completely joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก stress you out. Make an effort to drink water every day. Eat 6-8 servings of veggies ทางเข้าnigoal each day. Go for a walk every day. Even if it’s a 10 minute walk at first.

Sleep anxiety actually shares พนันออนไลน์ many common symptoms สล็อตออนไลน์ with generalized anxiety คาสิโนออนไลน์ disorder. In fact, the two แทงบอลออนไลน์ often go hand in hand. You หวยออนไลน์ don’t necessarily have to 123GOAL have both, but many people with 123BET one will have the other. This is especially the jokerslot case with generalized anxiety disorder. Difficulty joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก sleeping is a very common symptom for people with GAD, ทางเข้าnigoal and being sleep deprived can make their anxiety worse.

Your home is the place where you can พนันออนไลน์ return after a long day’s work สล็อตออนไลน์ to rest and recuperate. However, sometimes the คาสิโนออนไลน์ home just ends up becoming แทงบอลออนไลน์ another place for work adding หวยออนไลน์ to stress and fatigue you might 123GOAL already be feeling and draining your last 123BET dregs of energy. This is even more likely today, where the current state of affairs jokerslot has many of us working and learning joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก from home. While that doesn’t exactly make it a stress-free ทางเข้าnigoal home, it also doesn’t make it impossible; there are still ways to make your home more peaceful.

Everyone encounters obstacles at some point พนันออนไลน์ in life, and while they สล็อตออนไลน์ can be frustrating, it’s คาสิโนออนไลน์ actually overcoming obstacles that makes achieving your goals แทงบอลออนไลน์ and getting what you want so gratifying. It’s all หวยออนไลน์ about taking a hard look at what’s standing 123GOAL in your way and coming up with a plan to tackle it. Figure out what's holding you back and exactly why you 123BET are having trouble meeting them. You'll need jokerslot plenty of self-awareness to chart out a course of action. Try not to dredge up joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก your usual list of complaints, as this often falls ทางเข้าnigoal apart into excuses.

Exercise helps build strong, flexible muscles that พนันออนไลน์ will be less prone to injury. It สล็อตออนไลน์ can also help the healing process for คาสิโนออนไลน์ an aching back, prevent problems แทงบอลออนไลน์ in the future, and improve function. Work หวยออนไลน์ with your doctor to develop an 123GOAL exercise program, or seek a referral to 123BET another health professional who can. A good jokerslot program typically includes the three major forms of exercise: aerobic activity, strength training, and flexibility exercises. Most cases joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก of low back pain stem from strain or sprain due to simple overuse, ทางเข้าnigoal unaccustomed activity, excessive lifting, or an accident.

Perfect is different, and having a completely nigoal perfect life can only happen moments at a time. Setting SLOTXO goals can help you achieve more and เซ็กซี่บาคาร่า improve your life. Try to think of a เว็บเกมออนไลน์ goal that will challenge you, but is still attainable. Think สูตรสล็อต about things that make you happy, เว็บสล็อต then create goals around those things.Think ทดลองเล่นpg about short-term and long-term goals, and make them measurable. Create สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ goals for different areas of your life: career, nigoal ฝาก 50 รับ 100 romantic relationship, family, travel, fun, Nigoal personal growth and determine the ways to attain your goals.

The best way to identify what you’re nigoal passionate about is to pay attention SLOTXO to the daily tasks and activities that เซ็กซี่บาคาร่า make you feel excited, motivated. There เว็บเกมออนไลน์ might be a certain day of สูตรสล็อต the week or time of the day you look forward เว็บสล็อต to for some reason. Maybe it’s a specific ทดลองเล่นpg meeting, task or time you've set aside. You might also notice สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ certain surprises or unexpected times that nigoal ฝาก 50 รับ 100 end up being the best part of your day. Pay attention to both seemingly significant and insignificant things that you Nigoal would consider to be the peak of your day.

Idea Generation is the beginning of the nigoal process of innovation specifically SLOTXO for new products, innovative solutions, เซ็กซี่บาคาร่า or business models that are innovative. There เว็บเกมออนไลน์ are a variety of idea generation techniques สูตรสล็อต to help create new ideas. Brainstorming is an เว็บสล็อต example that is well-known, as are mind mapping, ทดลองเล่นpg role-playing, and reverse thinking. A successful สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ Idea Generation process is one that leads to questioning nigoal ฝาก 50 รับ 100 assumptions and opening existing methods to new ideas. Businesses find Nigoal idea generation activities that result in success, and each takes a different approach.

As you reflect on your story and begin to determine nigoal your values, you’ll naturally tune in SLOTXO to your self-talk. Perhaps you’ve เซ็กซี่บาคาร่า noticed it before. Is your self talk positive เว็บเกมออนไลน์ or negative, empowering or สูตรสล็อต disempowering. Does it encourage you to get เว็บสล็อต out of your comfort zone or keep ทดลองเล่นpg you living in fear? If you’re saying to yourself, How สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ can I possibly focus on finding myself then it’s time to silence your inner critic. Examine your thoughts as if you are your nigoal ฝาก 50 รับ 100 own best friend, replace them with empowering ones that push you toward your goals Nigoal instead of holding you back.

For many cats, it’s a good idea to create nigoal a feeding schedule, typically two meals a day, about 8 to 12 hours SLOTXO apart. Your vet can tell you how much your pet เซ็กซี่บาคาร่า should eat every day based on their เว็บเกมออนไลน์ size and how active they are. And though you may สูตรสล็อต worry that your cat will get เว็บสล็อต hungry, it’s best not to leave a bowl of food sitting ทดลองเล่นpg out all day. That can สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ mean your cat could decide to eat as much as they can, which nigoal ฝาก 50 รับ 100 could make them gain too much weight. If your cat begs when Nigoal you sit down to eat, resist the urge to feed them from your plate.

A life purpose has three components: It's nigoal a long-term calling, act, or way of life SLOTXO that interests you; it's something you have เซ็กซี่บาคาร่า some competence in; and it makes a เว็บเกมออนไลน์ marginal difference in the world. Striving สูตรสล็อต to be the best parent you can is a purpose, raising เว็บสล็อต kids to become caring, respectful, and happy ทดลองเล่นpg adults is your way of making a material impact whereas สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ wanting to make a lot of money with the sole intention of satisfying your every nigoal ฝาก 50 รับ 100 whim is not. It’s also common to have Nigoal multiple purposes in life.

A lot of people go through life thinking they’ll never แทงบอล be truly miserable. They see others who PG SLOT are miserable and assume that they Sexy gaming were somehow born with it. Others luck แทงบอล out and are born into miserable สล็อต families, or were given a head start 123GOAL and encouraged to be miserable by 123BET teachers and friends growing up. It seems unfair. สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส The beautiful thing about being human and living in such ทางเข้าnigoal a complex and incomprehensible world is that no matter what jokerslot happens, finding something shitty about it is never too difficult.

The new normal of working during แทงบอล the pandemic forces office people to PG SLOT work from their home instead of Sexy gaming the office. I have observed that more แทงบอล patients are coming in with neck pain and shoulder pain symptoms. Most สล็อต of them have a history with a non-ergonomic desk and chair, for example, 123GOAL using a dining table or a dressing table as a working desk which causes them 123BET pain from the office syndrome. This สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส will start from a little pain and become ทางเข้าnigoal worse until they cannot sit jokerslot and work for a long time.

Self-esteem can shift from moment to แทงบอล moment, and day-to-day. Sometimes, your PG SLOT sense of self-worth is high and you'll feel like Sexy gaming nothing can bring you down. Shortly afterward, แทงบอล your mind may become สล็อต flooded with negative thoughts. Maybe you 123GOAL start scrolling through social media with ample 123BET self-confidence after a great post, but soon สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส after, you feel it plummet. You can feel this change in your ทางเข้าnigoal self-esteem several times a day, even within the same hour. Having high self-esteem jokerslot takes energy every single day.

Nearly everything in your แทงบอล surroundings affects you in one way or another. Sometimes PG SLOT the slightest sensory detail, a persistent Sexy gaming sound or odor can introduce stress แทงบอล into your life, often subconsciously. When สล็อต you’re out and about, you don’t 123GOAL have much control over your 123BET environment. At home, however, you สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส have the ability to control many aspects of your surroundings. And exercising that ทางเข้าnigoal control is crucial to creating a healthy living environment. To create a clean, healthy jokerslot living space, you’ll need to declutter.

Regardless of the time of day you choose, the point is to แทงบอล spend some time focusing on your worrisome PG SLOT thoughts. Worries will still come Sexy gaming up at times outside of your scheduled แทงบอล worry time. When they do, briefly acknowledge them, สล็อต but only give them your 123GOAL full attention during your scheduled worry time. By making 123BET a commitment to rumination sessions, you may begin to notice สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส that you are in control of your worrying. Scheduling ทางเข้าnigoal your worrying time helps you to break the chain of frequent worrying you jokerslot experience throughout the day.

Nothing feels worse than your alarm แทงบอล clock going off when you’re not ready for it. You PG SLOT hit the snooze button once, twice, or quite Sexy gaming a few times, only to keep waking up feeling แทงบอล tired. And even when you do drag yourself out สล็อต of bed, you go 123GOAL about your morning routine with fatigue that lingers long into 123BET the day and the urge to grab the strongest energy drinks สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส that out there. If you haven’t been meeting your ทางเข้าnigoal sleep needs, you’ll have built up a sleep debt, and this debt will make you feel tired jokerslot as your body simply hasn’t had enough sleep.

Any carb-containing food will temporarily สล็อตออนไลน์ increase your blood แทงบอล sugar while glucose is being แฮนดิแคป absorbed, regardless of the สร้างรายได้ time of day. However, apart from providing your body with energy and other nutrients, this has no special benefit. There is no [url=https://123goal.net/%e0%b9%80%e0%b8%a7%e0%b9%87%e0%b8%9a%e0%b8%aa%e0%b8%a5%e0%b9%87%e0%b8%ad%e0%b8%95/]เว็บสล็อต need to “wake up” your digestive system, ทดลองเล่นpg as it’s always prepared to jump into action the moment เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ that food touches your tongue, no matter what time it is. And ทางเข้าเล่นpg wallet while eating a meal high in carbs might temporarily pg สล็อตเว็บตรง cause your body to use carbs as fuel, it doesn’t change the overall rate of your metabolism’ The truth is that fruit is healthy any time of the day.

Balance is not something that you สล็อตออนไลน์ inherently have or don't it's something เกมส์สล็อต you have to practice and แฮนดิแคป actively work to improve. Numerous studies สร้างรายได้ show that balance can be significantly improved through exercise. Research [url=https://123goal.net/%e0%b9%80%e0%b8%a7%e0%b9%87%e0%b8%9a%e0%b8%aa%e0%b8%a5%e0%b9%87%e0%b8%ad%e0%b8%95/]เว็บสล็อต also indicates that balance training ทดลองเล่นpg helps reduce the risk of injury เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ by lowering the risk of falls in older adults and the risk of ankle ทางเข้าเล่นpg wallet and knee injuries in people of all ages. Improving your balance pg สล็อตเว็บตรง is key to maintaining an active lifestyle.

All humans have a tendency to be a bit more สล็อตออนไลน์ like Eeyore than Tigger, to ruminate more on bad เกมส์สล็อต experiences than positive ones. It’s an evolutionary แฮนดิแคป adaptation over-learning from the dangerous สร้างรายได้ or hurtful situations we encounter through โปรโมชั่น life helps us avoid them in the future เว็บสล็อต and react quickly in a crisis. Don’t try to stop negative thoughts. Telling ทดลองเล่นpg yourself “I have to stop thinking about this,” only makes เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ you think about it more. Instead, ทางเข้าเล่นpg wallet own your worries. When you are in a negative cycle, acknowledge it. “I’m worrying pg สล็อตเว็บตรง about money.” “I’m obsessing about problems at work.”

Difficult times or life challenges can สล็อตออนไลน์ have you feeling like you’ve lost your เกมส์สล็อต sense of direction. From not getting enough แฮนดิแคป rest to facing an unprecedented สร้างรายได้ pandemic, burnout can make you feel stuck โปรโมชั่น and unsure where to turn. Self-limitation เว็บสล็อต and self-sabotage are often the results ทดลองเล่นpg of looking for a way out. Whether it’s a career เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ or a relationship you’re unhappy with, you may unconsciously engage in ทางเข้าเล่นpg wallet self-sabotaging behavior. You may also live with pg สล็อตเว็บตรง something called impostor syndrome, where you doubt your self-worth and capabilities.

If you're stressed, whether by your job or สล็อตออนไลน์ something more personal, the first step เกมส์สล็อต to feeling better is แฮนดิแคป to identify the cause. The most unhelpful สร้างรายได้ thing you can do is turn to something unhealthy โปรโมชั่น to help you cope, such as smoking or drinking. Not taking เว็บสล็อต control of the situation and doing nothing can ทดลองเล่นpg make your problems worse. Some of เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ the keys to good stress management are building ทางเข้าเล่นpg wallet emotional strength, being in control of your situation, pg สล็อตเว็บตรง having a good social network, and adopting a positive outlook.

Learning something new every day สล็อตออนไลน์ is a great way to keep your brain เกมส์สล็อต sharp as you age. The practice แฮนดิแคป can improve your concentration, memory, สร้างรายได้ and problem solving, and could also reduce โปรโมชั่น the chance of developing เว็บสล็อต dementia. We don't want our brains to ทดลองเล่นpg become lazy, because a lazy เว็บตรงไม่ ล็อค ยู ส ไม่มี ขั้นต่ำ brain can often have trouble recalling words ทางเข้าเล่นpg wallet and ideas. Working to feed your mind a new tidbit of information pg สล็อตเว็บตรง regularly will keep the organ sharp and alert because humans crave novelty and growth.

Success isn’t about reaching your goals. It’s about หวย enjoying the process. If you’re in คาสิโนออนไลน์ a hurry, your accomplishments won’t make you feel content สร้างรายได้ and fulfilled. Take a Step Back to Run Faster. At บาคาร่า some point, you need to give ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร yourself a break. You need to unplug from the grid 123BET and recharge your batteries. This doesn’t 123GOAL mean that you should completely abandon your สล็อตเว็บตรงแตกง่ายไม่ล็อคยูส responsibilities. But it does mean that you should take time for yourselves to relax, reflect, 168 สล็อต and rejuvenate. So if you’re feeling burned out, nigoal ฝาก 50 รับ 100 don’t be afraid to give yourself a break.