Полная версия страницы  English  

сшивка белков

Pages: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14
NatKo, 04.12.2002 16:02
Помогииииите, пожааалуйста!
Мне нужно почистить АТ, полученные к 24-субъединичному белку. К Sepharose-BrCN я этот белок пришила, но при элюции АТ (при рН=3) вместе с ними выходят и субъединицы. Как от этого избавиться?
заранее благодарна за помощь <img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" />
Dimych, 04.12.2002 20:46
Возможны разные варианты.
1. Оставить все как есть, предварительно отмыв колонку от "лишних" субъединиц. Можно сказать наверняка, что пошился Ваш белок вполне статистически и останется на колонке "всякой твари по паре". Даже поболее немного. Емкость будет несколько ниже, чем если бы там висело все, но все ж лучше, чем загрязненные образцы.
2. Перешить белок глутаром или еще чем. Глутаровые сшивки, правда, неустойчивы в кислых рН. Ну и сам подбор условий занятие отдельное, поскольку при передозировке у Вас будет преципитат, а при недошиве проблемы останутся. Так что первый вариант видится мне наименее хлопотным и наиболее надежным.
Veshka, 04.12.2002 22:28
Перешивать надо или ДМАПОМ или BS3. А по сути - согласен.
Dimych, 04.12.2002 23:03
Veshka
Будь добреньким, расшифруй, не ленись. Или скажи, кто этим добром торгует, а я уж сам описания гляну. Интересно мне - вдруг сгодится. Я кроме глутара ничем не пользовался, самому тыкаться и искать ломы, да и не так, чтобы уж очень дешево.
Lex, 05.12.2002 03:30
BS3 ot Pierce ili analogi, no... podbirat' nuzhno, a u Pierce dorogo
NatKo, 05.12.2002 14:45
Dimych
спасибо за советы
но даже в третий! раз при промывании рН=3 (второй и третий - без АТ)субъединицы сходят тока в путь :-(( Хотя, может, в четвертый раз помыть? :-))я все-таки попробую :-))
как я поняла при таком значении рН глутаровый альдегид поможет, как мертвому... :-))
поэтому, уважаемый Veshka! скажите пожалуйста, где можно узнать о методах использования упомянутых Вами веществ? спасибо
Dimych, 05.12.2002 18:49
NatKo
На счет промывки: поставьте объем побольше и в путь. Ну и соли милимолей 200 (извиняюсь, что про это советую, но я и сам иногда забывал тривиальные вещи). Может быть имеет смысл отмывка с мочевиной или гуанидином.
Midgardsormen, 05.12.2002 19:03
ну хотя бы тут
http://www.piercenet.com/Objects/View.cfm?...pe=File&ID=0418
оттуда грузится пдф. Вообще потыркаться по пирсу нехило
Veshka, 05.12.2002 21:13
Да, вот пока у нас сеть висела, Орм уже всё и сказал. И Пирс, действительно оченно полезная фирмочка по части химии белка и иммунометодов...
Aronich, 05.12.2002 21:36
Моgет бит глупост,
но почему не попробиват
crosslink еше в растворе
(naprimer HMDC - hexamethylene diisocyanate
targets aminogroups)
а потом вязат на агарозу
Dimych, 05.12.2002 21:39
Угу, спасибо. Пирс я уже рыл маленько раньше, просто названий не помню, особенно в сокращениях. Тем более мне был нужен реагент на аргинины, а таковой нашел всего один, да и то мне не подходящий frown.gif Если кто знает быка-производителя, поделитесь инфой! Мине надоть диглиоксаль с линкером подлиннее фенила. Ну не варить же это добро самому! С меня органик тот еще.
Tom1, 06.12.2002 17:24
Вопрос а все субединизы выходят или как???
Может есть смысл пришить только ту субединизу на которую реально получены антитела?????
[Текст переведён с транслита]
NatKo, 09.12.2002 15:16
Tom1
ха! в том и дело, что АТ-то поликлональные! :-)) выделенные осаждением каприловой кислотой они дают такую неспецифику, что тесты ... сами понимаете какие :-(( поэтому я и решила их аффинно очистить
если вы спросите, почему у меня нет моноклонов - потому что в беларусской науке счас сложно с деньгами :-((
а ответить на вопрос, все ли субъединицы выходят, я не могу, потому как их аж 24, и этот белок самопроизвольно собирается.
но наверняка на агарозе чего-то остается
Aronich
если не получится с агарозой, придется, скорее всего сшивать в растворе - просто белка жалко
Midgardsormen
спасибо за ссылку
Dimych
спасибо, соли как раз столько и добавляла :-))) ничуть не обижаюсь :-)) пойду забивать колонку :-))
NatKo, 09.12.2002 15:41
Veshka
тоже спасибо :-))
Tom1, 09.12.2002 17:20
Ну и что что поликлональные???
Естно что на какую-то субединизу ответ лучше чем на остальные.
За это и горовит сваливание белка с аффинной колонки.
Что значит не возмогно посмотреть какие дополнительно шодят??
Что копплекс устоичив к SDS i 2-Meo слабо вериться...
кстати о птичках судя по всему кролика кололи всеми субединизами сразу тогда и моноцлональные антитела не помогут...
Я думау что надо выделить одну субединицу и на нее получить антитела....
[Текст переведён с транслита]
NatKo, 09.12.2002 18:25
Tom1
на счет моноклонов к субъединице - надо будет сказать шефьям, когда деньги появятся
а кроликов действительно кололи "цельным белком",но состоящим из одинаковых субъединиц
а можно Вас по-Email'u вопросами закидать? <img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" />
Tom1, 09.12.2002 18:39
Нет проблем
[Текст переведён с транслита]
Midgardsormen, 09.12.2002 21:19
Ну ежели белок одинаковый, то имеет смысл вернуться к совету Димыча нумер раз и просто мыть колонку в режиме mock elution. Если проблема со сходом антигена с колонки простой отмывкой не решается, то доп. сшивка может и не помочь - если у вас первичная пришивка на колонку плохо работает (если хорошо, то по идее после mock elution антиген слезать не должен). В этом случае один из наиболее простых и надежных способов очистки от загрязнений антигеном это использование His6-тагнутого антигена для исготовления аффинной колонки - слезающий антиген после диализа в нейтральный буфер убирается Ni-NTA. Кстати, если использовать фрагменты исходного антигена, то можно подразделить поликлоны на сеты, узнающие определенную часть белка. Разумеется, лично я предпочитаю использовать такой вот фрагмент уже для иммунизации - вместо того, чтобы потом пытаться картировать эпитопы антител.
Tom1, 09.12.2002 22:34
Что-то я не понял он что из 24 одинаковых субединиц состоит??? Тогда точно не вижу снысла колоть нативным.
Что касаемо слабои пришивки антигена на гель дык это как два пальза об асфальт если бромциан старый. Я уже тут когда-то писал что лучше на епокси шить...
P.S. To:Worm..
А в какои лабе был в UW по времени должны были пересекаться....
Я там был с 1999-2001
[Текст переведён с транслита]
Midgardsormen, 09.12.2002 22:44
У R.R. Burgess в McArdle Lab for Cancer Research, aka баальшое грязное здание.
Tom1, 09.12.2002 22:55
Sorry блин ведь видел что McArdle Lab for Cancer Research как -то сразу не сообрасзил -UW для меня это Univ. of Washington...

[Текст переведён с транслита]
Midgardsormen, 09.12.2002 23:00
that's you-wash tongue.gif Unlike wash-you, which is Washington U. Although somebody thought I was going to Oklahoma State, when I told him I about my job at OSU [img]laugh.gif" border="0[/img]
Tom1, 09.12.2002 23:18
А по поводу McArdle Lab for Cancer Research я так среагировал т.к. там бывший конкурент работает некто старичек
Deuscht
[Текст переведён с транслита]
[Текст переведён с транслита]
Tom1, 10.12.2002 02:20
To:Midgardsormen
Kakoj u tebya e-mail chto posle vladimir????
Midgardsormen, 10.12.2002 06:06
_sv as in vladimir_sv@hotmail.com
NatKo, 10.12.2002 18:32
спасибо за советы
да, белок состоит из 24х одинаковых субъединиц
когда антитела получали, меня не спрашивали (никого не спрашивали), как бедных кроликов колоть - жираф большоой
так что у меня есть антисыворотки, у которых достаточно высокий титр специфических АТ, но почему-то при их выделении (я упоминала - каприловой кислотой) они дают огромную неспецифику и очень небольшое связывание - может, вообще собака порылась в выделении этих АТ
по поводу совета номер один Dimycha - соотношение сходящих с колонки АТ и субъединиц (при рН=3)примерно 1:10,а при промывке вначале обычным буфером (рН=7,4, соль и т.п.)они не смываются - так что вроде BrCN живой
Tom1, 10.12.2002 18:37
Вот не лублю я каприловую кислоту сульфатом оно как то просще и надежнее а потом на анионообменнике и все если тем более титр хороши.
[Текст переведён с транслита]
NatKo, 10.12.2002 18:56
это сразу 45%(или 50? или сколько?), потом просто ресуспендировать - и на колонку?
Midgardsormen, 10.12.2002 20:19
По мне так хоть 24 раза по одному колоть, что один раз по 24 smile.gif Я просто думал, что субъединицы разные и не все на колонку шьются, вот ты их сшивать и надумала. А если одно и то же то надо мыть. Я тут поговорил с народом, который занимается иммуноаффинами постоянно - говорят, может сефароза лететь на рН 3. Советуют пирсовский gentle elution buffer с нейтральным рН или просто соли навалять, типа 5 М иодида натрия. То есть если моешь и моешь своим буфером для элюции, а белок все сходит и сходит, то скорее всего сефароза в низком рН подсаживается, емкость падает, ну и т.п.
Tom1, 10.12.2002 20:32
Ну естно старая бром циан сефароза в екстремальных значениях pH будет терят пришитый белок.
50% только насыщения!!!!
потом осадок диализнуть против буфера с низкои солью и на анионнообменник иммонoглобулины в проскоке. если все аккуратно делать то на форезе видно только 5-6 полос причем IgG мажорная.
[Текст переведён с транслита]
Tom1, 10.12.2002 20:34
To: Midgardsormen
Ты мои е-маил получил???
[Текст переведён с транслита]
Tom1, 10.12.2002 20:35
To: Midgardsormen
Ты мои е-маил получил???
[Текст переведён с транслита]
Midgardsormen, 10.12.2002 22:49
Получил, поспрашивал тут вокруг - никаких особенно оригинальных идей, мыть щелочью и метанолом, пока не придет щастье. Сорьки, мы еще акту недолго ломаем, ошибки 25 не было пока. Ответ послал с обратным мылом.
NatKo, 11.12.2002 17:20
Tom1
спасибо, только колонку уравновешивать буфером с такой же солью как в диализе или без оной?
Midgardsormen
может, и сефароза+белок так реагирует на экстрим, потому как в ИФА она нормально взаимодействует с АТ (хоть и с высокой неспецификой) - а там промывка далеко не одна
Tom1, 11.12.2002 18:26
Естно таким же иначе какои смысл...
прилагаю описание выделения ..sorry за англисиский это я тут для местных лаборантов переводил...
Scheme of purification IgG from rabbit serum.
Add to serum sodium sulphate ( to 50%) mix overnight and spin down 6000rpm-10000rpm 0.5 h.
Or add to serum 1v of 50% PEG-6000 (2v serum –1v PEG)
Pellet solved in min. volume of next buffer 25mMtris, 35 mM NaCl pH 8.8 (buffer A)
If you used sodium sulphate you must dialyzing sample against the same buffer 4h two times.
If you use PEG you can use the sample w/t dialyzing.
In the next step will apply the sample to DEAE resin ( usually I used DEAE-Trisarcryl M),
which equilibrated with buffer A.
IgG not bind to resin. ( see fig 1.)
The ballast proteins was eluted with next buffer 25mM tris 1M Nacl pH 8.8.
If you want concentrating IgG you can do next step.
Dialyzing IgG against 20mM HEPES 150mM NaCl pH 7.4 overnight 4 times.
Apply the IgG solution to HTP resin and will elute the IgG by 2000mMNaPi pH7.2
(see fig 2.)
Column size for purification IgG from 50ml serum
DEAE 2.5x16.5 cm (v =80ml)
HTP 2.5x4.5 cm (v=28ml)


[Текст переведён с транслита]
Tom1, 11.12.2002 18:29
P.S. I send this scheme by e-mail to...
NatKo, 11.12.2002 18:54
Tom1 - спасибо-спасибо
мне тут еще насоветовали как можно избавиться от глициновых буферов - достаточно просто, поэтому наводит на мысль о гениальности и успехе :-))
3% этанолом или банальным 2М NaCl - говорят, получается
Tom1, 11.12.2002 18:57
Может и получится все зависит от своиств ваших антител...
[Текст переведён с транслита]
NatKo, 11.12.2002 19:45
только шефиня не верит и заставляет меня все-таки эти субъединицы сшивать - ну и ладно, блиин
123goal 123goal, 10.11.2022 19:04
Insomnia is the inability to fall 123 gold asleep or stay asleep at night, resulting in unrefreshing or non-restorative sleep. And it’s a very nigoal ฝาก 50 รับ 100 common problem, one that takes a toll on your ทดลองเล่นสล๊อต energy, mood, and ability to function during slotxo ฝาก 10 รับ 100 ทำยอด 200 ถอนได้เลย the day. Chronic insomnia can even contribute to serious health ทางเข้าเล่นpg wallet problems. Some people struggle to get to sleep joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก no matter how tired they are.
123goal 123goal, 11.11.2022 10:54
Your credit can determine whether 123 gold you’re able to get loans and the rates you pay on them, as well as many other aspects of your financial life. A credit nigoal ฝาก 50 รับ 100 check may be part of getting a cell phone plan, apartment ทดลองเล่นสล๊อต or car insurance. To stay on top of your score, focus on the two biggest factors that influence it: payment history and credit utilization. Aim slotxo ฝาก 10 รับ 100 ทำยอด 200 ถอนได้เลย to pay everything on time, because just ทางเข้าเล่นpg wallet one missed payment can hurt your score, and use less than 30% of your joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก credit limits on each card and overall.
123goal 123goal, 12.11.2022 10:18
Have you ever wanted to go to sleep 123 gold early, only to find it impossible? Maybe you have to wake up a few hours earlier than usual on a particular nigoal ฝาก 50 รับ 100 day for an early conference call or perhaps you need to prepare for travel across time zones to limit jet lag. So you ทดลองเล่นสล๊อต want to compensate by going to bed a few hours slotxo ฝาก 10 รับ 100 ทำยอด 200 ถอนได้เลย earlier the night before in order to keep your total sleep time the same. If only it ทางเข้าเล่นpg wallet were this simple. It might be tempting to stock up on sleep medicines and joker888 เครดิต ฟรี ไม่ ต้อง ฝาก other sleep aids for a quick fix.
guest: 123vega , 12.11.2022 11:46
A long, beautiful stretch SUPERSLOT เครดิตฟรี of sand in Australia's สล็อต โร มา เว็บตรง tropical far north, Wangetti Beach, was Toyah ทดลองเล่นสล็อตโรม่า Cordingley's favourite beach. It is also where she died, in what ROMA SLOT has been called a "frenzied and brutal and sadistic" attack. SLOT JOKER The 24-year-old had gone to the SLOTXO beach to walk her dog on 21 October 2018, as she เครดิต ฟรี กด รับ เอง 50 บาท had done countless times before, but never came home. The PG SLOT ซื้อฟรีสปิน next morning her father found her "messed up" body half buried in sand dunes. Her JOKER ROMA เว็บตรง beloved dog was tied up nearby, unharmed. Four PG SLOT ทางเข้า years on, Australian authorities are appealing for the public's help in an international hunt to find the man they believe killed Toyah - Rajwinder Singh.
123goal 123goal, 14.11.2022 11:09
It is important to consume adequate Nigoal calories and protein to help maintain energy and muscle mass. The right amount of สล็อต calories and protein help your body 123GOAL fight infection, maintain muscle mass, and บาคาร่าคืออะไร help prevent skin breakdown. If you are underweight, the สูตรบาคาร่า goal for healthy weight gain is a slotxo gain of ½ to 2 pounds per week. This can usually be ทดลองเล่นสล๊อต accomplished by eating at nigoal least 250-500 more calories per แทงบอล day than you normally do. If your doctor or ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร dietitian has told you that weight gain is appropriate for you.
123goal 123goal, 15.11.2022 11:26
Daily exercise helps you maintain a healthy Nigoal sleep schedule, but experts Trusted Source recommend สล็อต avoiding exercise late at 123GOAL night, if you want to sleep บาคาร่าคืออะไร well at night. That’s because your สูตรบาคาร่า body produces a lot of energy when slotxo you exercise, which can keep you ทดลองเล่นสล๊อต awake. If you’re trying to stay up all night, try 30 to 40 minutes nigoal of aerobic exercise. If you don’t want to exercise, try แทงบอล getting up and moving around. Pace back and forth ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร for 10 minutes, take a walk outside, or do a few jumping jacks.
123goal 123goal, 16.11.2022 10:47
Getting a good night’s sleep may seem like an Nigoal impossible goal when you’re wide awake at 3 a.m., but you have สล็อต much more control over the 123GOAL quality of your sleep than you probably บาคาร่าคืออะไร realize. Unhealthy daytime habits and สูตรบาคาร่า lifestyle choices can leave you tossing and turning slotxo at night and adversely affect your mood, ทดลองเล่นสล๊อต brain and heart health, immune system, creativity, vitality, and nigoal weight. But by experimenting with the แทงบอล following tips, you can enjoy better sleep at night, boost ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร your health, and improve how you think and feel during the day.
123goal 123goal, 17.11.2022 10:28
Eating spicy foods can Nigoal cause heartburn, which can impact สล็อต your sleep, And when you lie down, 123GOAL acid reflux often worsens. If you have sleep บาคาร่าคืออะไร apnea, your symptoms may worsen, too, if the สูตรบาคาร่า backed-up acid irritates slotxo your airway. What’s more, research ทดลองเล่นสล๊อต shows that consuming red pepper nigoal can increase your core body temperature, which is แทงบอล disruptive since core body ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร temperature naturally drops during sleep.
123goal 123goal, 18.11.2022 10:48
Each dietary pattern impacts Nigoal different predictors of health. What was สล็อต notable about this study is it 123GOAL investigated a spectrum of plant-based บาคาร่าคืออะไร eating styles. It turns out, a strict vegan diet สูตรบาคาร่า produced the highest levels of healthy slotxo biomarkers and the lowest levels of ทดลองเล่นสล๊อต unhealthy markers. Vegetarians who nigoal include eggs, dairy and/or fish scored next best. The non-vegetarian แทงบอล group had the least favorable health ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร markers in their blood, urine and tissue samples.
123goal 123goal, 19.11.2022 09:46
Big dinners make you temporarily Nigoal drowsy but prolong digestion, which สล็อต interferes with a good night's 123GOAL sleep. It's best to eat your biggest meal บาคาร่าคืออะไร before midafternoon and have a light สูตรบาคาร่า evening meal of 500 calories or less. Include slotxo some chicken, extra-lean meat ทดลองเล่นสล๊อต or fish at dinner to help curb middle-of-the-night nigoal snack attacks. Spicy foods can contribute to แทงบอล sleep problems: Dishes seasoned with garlic, chilies, cayenne, or other ลิงค์รับทรัพย์คืออะไร hot spices can cause nagging heartburn or indigestion. Avoid spicy foods at dinner.
123goal 123goal, 21.11.2022 06:28
If sunlight hurts your eyes and results in nigoal ฝาก 50 รับ 100 significant or frequent pain, you may have สล็อต เว็บตรงไม่ผ่านเอเย่นต์ไม่มีขั้นต่ำ photosensitivity or photophobia - extreme 123 sensitivity to light. This could be due to a medical บาคาร่า123 condition, dry eye or damage to your eyes, so you should สูตรบาคาร่าฟรี check with your eye doctor if you เว็บสล็อต pg เว็บตรง 123 feel pain in your eyes due to sunlight or bright light. People with jokerslot sensitive eyes, in general, can wear nigoal123 sunglasses to help lessen their ราคาบอล sensitivity when outdoors. Wind and sun can make eyes ลิงค์รับทรัพย์ feel more irritated and sensitive, but sunglasses can help in both cases.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.