Полная версия страницы  English  

ПЦР

Pages: 1, 2
Guest, 01.09.2010 16:21
не подскажете какую полимеразу лучше использовать для ПЦР?
bklimovich, 01.09.2010 16:52
ну, исходя из вопроса могу порекомендовать термостабильную))
уточните вопрос: какого производителя или какой тип полимеразы или что то еще? какой ПЦР? рутинная амплификация/длинный ПЦР/точный ПЦР. от всего этого зависит ответ
-Ъ-, 02.09.2010 09:43
Очередной троллинг... frown.gif
Guest, 02.09.2010 11:27
(-Ъ- @ 02.09.2010 09:43)
Ссылка на исходное сообщение  Очередной троллинг... frown.gif

ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?
-Ъ-, 02.09.2010 12:35
(Guest @ 02.09.2010 12:27)
Ссылка на исходное сообщение  ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?

Берите то, что есть под рукой. Может быть под промоторные области спецполимеразы выпускаются confused.gif , не знаю.
Guest, 02.09.2010 17:29
(Guest @ 02.09.2010 11:27)
Ссылка на исходное сообщение  ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?


Такара СпидСТАР ХС с хот-старт антителами smile.gif
petr, 02.09.2010 17:39
(Guest @ 02.09.2010 09:27)
Ссылка на исходное сообщение  ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?

Не заморачивайтесь, ПЦРьте обычным Тагом, если у Вас конечно промоторная область в пределах 2кило (обычно меньше).
-Ъ-, 02.09.2010 22:05
(Guest @ 02.09.2010 18:29)
Ссылка на исходное сообщение  Такара СпидСТАР ХС с хот-старт антителами smile.gif

А раньше антитела игнорировал... wink.gif
mrotzek, 02.09.2010 22:49
(-Ъ- @ 02.09.2010 23:05)
Ссылка на исходное сообщение  А раньше антитела игнорировал... wink.gif

да ладно smile.gif антитела хороши если прямо с коровьего говна и в ПЦР на псевдотуберкулез -
а если твоими магнитными шариками - я честно ТакМан по прописи smile.gif)))))))))))) 40 циклов 95-60 градусов -ампликоны 70-90bp smile.gif Как русские классики ТакМан ПЦР учут smile.gif)))))))))))))
-Ъ-, 03.09.2010 10:04
(mrotzek @ 02.09.2010 23:49)
Ссылка на исходное сообщение  да ладно smile.gif антитела хороши если прямо с коровьего говна и в ПЦР на псевдотуберкулез -

Дк, это же самое главное в жизни... smile.gif
-Ъ-, 03.09.2010 10:07
(mrotzek @ 02.09.2010 23:49)
Ссылка на исходное сообщение  а если твоими магнитными шариками - я честно ТакМан по прописи smile.gif)))))))))))) 40 циклов 95-60 градусов -ампликоны 70-90bp  smile.gif Как русские классики ТакМан ПЦР учут smile.gif)))))))))))))

Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif
mrotzek, 03.09.2010 19:28
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif


smile.gif уболтал норвежские магнитные шарики регулярно ингибируют вирус ПЦР диагностику при 10-50 нанограмм на 20 мкл реалтайм ПЦР с ТакМанами и СИБР на АБИ Степане-48 и Степане-96 , кстати центрифужные микроспин киты Квакагена, Роша и прочих "умельцев" на "стеклянных бумажках" тоже не лучше frown.gif перехажу нахрен взад на этанол-хлороформ smile.gif задолбали уже smile.gif
mrotzek, 03.09.2010 19:42
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif

я более 20 лет ПЦРю 50 нанограм фенол-хлорофом ДНК на 20 миклов реакцию и проблем не имел smile.gif чето того в "датском каралевстве " принц Гамлет smile.gif))
mrotzek, 03.09.2010 19:58
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif


ты свои шарики проверь в паралель с "голден стандарт фенол-хлороформ" smile.gif
mrotzek, 03.09.2010 20:09
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif


smile.gif делай стандартный фенол-хлорофом smile.gif для контроля smile.gif
mrotzek, 03.09.2010 20:18
стандартный кит для выделения днк методом сорбции на "стекло" на рынке стоит примерно 2-5 евро на образец - все киты всех компаний говно и по чувсвительности хуже , чем классичесский "фенол-хлороформ" smile.gif Анализ современного рынка ПЦР smile.gif))))))))))))
mrotzek, 03.09.2010 20:30
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Ты мои магнитные шарики еще не видел. no.gif Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение". wink.gif


для геномного сиквинирования чиловека я южу ДНК выделенную тока классическим "фенол-хлороформом" smile.gif)))))))))))))
Yuri K, 04.09.2010 00:02
И как же это у тебя Тм гуляет плюс-минус 5 градусов после Ф-Х?! Я в растерянности.

Ты опять фишку не сечешь и сравниваешь яблоки с апельсинами.

ПЦР напрямую с защечных мазков, обработанных эпицентровским набором (там, ИМХО, Протеиназа К) идет прекрасно. Т е если образец нужен для ПЦР (напр., генотипирование), не надо ни стеклянных бумажек, ни шариков. Берешь мазки, греешь с Раствором Номер 1 по протоколу, потом храняться год при -20 (дольше не проверял). Сиквенс не делал, но ИМХО если так ПЦР идет, проблем не будет.

Если тебе нужно 10 лет один образец пользовать, т е нужна тонна ДНКи одного донора, тогда Кровь, Фенол и Хлороформ. Но много мелких образцов (напр, плазмидные минипрепы) фенолить задолбаешься, поэтому тут народ пользует разные колонки с силикатами, и правильно делает.

А шарики, это хайсрупут анализ мочи и прочего кала из задниц на патогены.

Короче, каждому свое.
mrotzek, 04.09.2010 01:22
(Yuri K @ 04.09.2010 01:02)
Ссылка на исходное сообщение  И как же это у тебя Тм гуляет плюс-минус 5 градусов после Ф-Х?! Я в растерянности.

Ты опять фишку не сечешь и сравниваешь яблоки с апельсинами.

ПЦР напрямую с защечных мазков, обработанных эпицентровским набором (там, ИМХО, Протеиназа К) идет прекрасно. Т е если образец нужен для ПЦР (напр., генотипирование), не надо ни стеклянных бумажек, ни шариков. Берешь мазки, греешь с Раствором Номер 1 по протоколу, потом храняться год при -20 (дольше не проверял). Сиквенс не делал, но ИМХО если так ПЦР идет, проблем не будет.

Если тебе нужно 10 лет один образец пользовать, т е нужна тонна ДНКи одного донора, тогда Кровь, Фенол и Хлороформ. Но много мелких образцов (напр, плазмидные минипрепы) фенолить задолбаешься, поэтому тут народ пользует разные колонки с силикатами, и правильно делает.

А шарики, это хайсрупут анализ мочи и прочего кала из задниц на патогены.

Короче, каждому свое.



Юр - я всегда верил в твою мудрость smile.gif но споры бактерий в кале без беад-беатера не рушатся smile.gif Привет жене и детям smile.gif
Yuri K, 07.09.2010 17:06
(mrotzek @ 04.09.2010 01:22)
Ссылка на исходное сообщение  Юр - я всегда верил в твою мудрость smile.gif но споры бактерий в кале без беад-беатера не рушатся smile.gif Привет жене и детям smile.gif

Ну лизис это типа отдельный вопрос. Еще одно приложение для шариков, кстати, это анализ разного рода цитологических образцов, загаженных альдегидами или просто сильно разбавленных, как моча (РС, ШурПасс етц.). Не будешь же ты фенолить мочу напрямую? Никакого фенола не хватит на такие объемы. В общем, метод определяется типом исходного материала и объемом проекта.
Сергей)), 22.04.2012 08:15
Подскажите пожалуйста, в чем особенностей TaqMan пцр? Если не сложно опишите методику=)))
Guest, 22.04.2012 10:03
http://molbiol.ru/protocol/12_07_02.html
и далее по списку.....

Вот мне одно интересно, если людям невдомек пользование писком по порталу, как они в пабмеде ориентируются? Без обид...
-Ъ-, 23.04.2012 17:30
(Сергей)) @ 22.04.2012 09:15)
Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста, в чем особенностей TaqMan пцр? Если не сложно опишите методику=)))

http://dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html
-Ъ-, 23.04.2012 17:40
(Сергей)) @ 22.04.2012 09:15)
Ссылка на исходное сообщение  Подскажите пожалуйста, в чем особенностей TaqMan пцр? Если не сложно опишите методику=)))

В том, что используется две активности одного фермента - Так-полимеразы -
полимеразная и 5-штрих экзонуклеазная. Или другими словами, никтранслязная активность полимеразы, которая расшивает Пробу, блокированную с 3-штрих конца.........
Это самый нечувствительный метод из известных методов Реал тайм ПЦР детекции. smile.gif , которым весь мир тупо пользуется, глядя друг на друга. tongue.gif
Агроном, 26.04.2012 09:55
(-Ъ- @ 23.04.2012 18:40)
Ссылка на исходное сообщение  В том, что используется две активности одного фермента - Так-полимеразы -
полимеразная и 5-штрих экзонуклеазная. Или другими словами, никтранслязная активность полимеразы, которая расшивает Пробу, блокированную с 3-штрих конца.........
Это самый нечувствительный метод из известных методов Реал тайм ПЦР детекции. smile.gif , которым весь мир тупо пользуется, глядя друг на друга. tongue.gif

Нуу, зато мультиплексность, еще большая специфичность... что я еще забыл? А! Претензии на колличественность проводимого анализа. Чувствительность - ей жертвовать приходится. Хотя недавно видел презентацию новой методики ПЦР-РТ, в которой ПЦР-реакция такмановская проходит в микрокаплях, флюоресценция считывается с каждой капли отдельно, чем достигается чувствительность до обнаружения 1 матрицы в пробе (цитируя разработчиков системы).
-Ъ-, 27.04.2012 10:43
(Агроном @ 26.04.2012 10:55)
Ссылка на исходное сообщение  Нуу, зато мультиплексность, еще большая специфичность... что я еще забыл? А! Претензии на колличественность проводимого анализа. Чувствительность - ей жертвовать приходится. Хотя недавно видел презентацию новой методики ПЦР-РТ, в которой ПЦР-реакция такмановская проходит в микрокаплях, флюоресценция считывается с каждой капли отдельно, чем достигается чувствительность до обнаружения 1 матрицы в пробе (цитируя разработчиков системы).

Специфичность - основная фишка ТакМана, которой машут манагеры, рекламируя реал тайм киты на ТакМанах. А на самом деле термин "специфичность" механически перенесен из гибридизационных доПЦР-ных методов (дот- и соузернов...). Но применительно к ТакМанам никто не задумывается над тем, как может обеспечить специфичность Проба, имеющая температуру плавления на 10 оС (!!!) (пусть даже на 5) выше чем у родных праймеров confused.gif confused.gif confused.gif А если выровнить Т пл. - прощай чувствительность вместе со "специфичностью!
Нет непосредственного контакта тушителя с источником - этим многое сказано. umnik.gif
А что делать, если размер ПЦР продукта около 50? confused.gif и т д. и т п...
ТакМаны - раздутый мыльный пузырб от Аплайда. yes.gif
Агроном, 27.04.2012 12:21
(-Ъ- @ 27.04.2012 11:43)
Ссылка на исходное сообщение  Специфичность - основная фишка ТакМана, которой машут манагеры, рекламируя реал тайм киты на ТакМанах. А на самом деле термин "специфичность" механически перенесен из гибридизационных доПЦР-ных методов (дот- и соузернов...). Но применительно к ТакМанам никто не задумывается над тем, как может обеспечить специфичность Проба, имеющая температуру плавления на 10  оС (!!!) (пусть даже на 5) выше чем у родных праймеров confused.gif  confused.gif  confused.gif А если выровнить Т пл. - прощай чувствительность вместе со "специфичностью!
Нет непосредственного контакта тушителя с источником - этим многое сказано. umnik.gif
А что делать, если размер ПЦР продукта около 50? confused.gif и т д. и т п...
ТакМаны - раздутый мыльный пузырб от Аплайда. yes.gif

Значицца так, по-порядку.
1) Температура плавления пробы естественно гораздо выше, ибо ДНК геномная длинна и не счесть связей водородных, скрепляющих цепи ее в горе и радости, пока денатурация на разлучит их. Температура плавления...эээ.. праймеров? Ладно, заменим на логически подходящее понятие "температура плавления пары матрица-праймер", так вот - эта температура ниже гораздо, так как праймер короток. Снизили мы температуру смеси до порога плавления пары праймера с матрицей, часть цепоцек ДНК ренатурировало, часть соединилась с праймерами. Пошла реакция полимеризации там, где прилипли праймеры, та часть что ренатурировала осталась как была. Вроде все специфично! А тут еще зонд. Зонд тоже должен специфически прилепиться. Итого мы имеем 4 специфические последовательности, которые должны совпасть - 2 праймера и 2 зонда.
2) Зонды меченные тушителем и флюорохромом короткие. Причем тут вообще размер ампликонов?
-Ъ-, 27.04.2012 15:32
Откуда второй зонд появился в такман-системе? О резонансных зондах я пока помалкиваю, пока о ТакМане. smile.gif
Специфичность от ТакМана - масло масленное, которое только ограничивает возможности Его Величества PCR.
А сопливое соотношение сигнала к фону - вообще атас!.

А в жизни приходится иметь дело и с оооочень короткими ПЦР продуктами, и меньше 50 бп. Даже MGB с LNA тут не спасет.
Агроном, 28.04.2012 07:57
(-Ъ- @ 27.04.2012 16:32)
Ссылка на исходное сообщение  Откуда второй зонд появился в такман-системе? О резонансных зондах я пока помалкиваю, пока о ТакМане. smile.gif
Специфичность от ТакМана - масло масленное, которое только ограничивает возможности Его Величества PCR.
А сопливое соотношение сигнала к фону - вообще атас!.

А в жизни приходится иметь дело и с оооочень короткими ПЦР продуктами, и меньше 50 бп. Даже MGB с LNA тут не спасет.

Нет, ну вообще то да, мне кажется суть спора сводится к тому, что в зависимости от целей лучше использовать разные методики. Такман весьма хорош для определенных задач.
Поясните пожалуйста, как длина ампликонов влияет на такман?
guest: -Ъ- , 01.05.2012 16:13
(Агроном @ 28.04.2012 07:57)
Ссылка на исходное сообщение  Нет, ну вообще то да, мне кажется суть спора сводится к тому, что в зависимости от целей лучше использовать разные методики. Такман весьма хорош для определенных задач.
Поясните пожалуйста, как длина ампликонов влияет на такман?

Согласитесь, на троих сообразить на кусочке длиной 50 пн сложновато! smile.gif
Можно конечно, но в том случае, если на 100% LNA-зировать все олиги, или же катионизировать пробу спермином. confused.gif Но это в крайнем случае, когда "нам нужна победа и мы за ценой не постоим". umnik.gif
Агроном, 02.05.2012 08:09
(guest: -Ъ- @ 01.05.2012 17:13)
Ссылка на исходное сообщение  Согласитесь, на троих сообразить на кусочке длиной 50 пн сложновато! smile.gif
Можно конечно, но в том случае, если на 100% LNA-зировать все олиги, или же катионизировать пробу спермином. confused.gif Но это в крайнем случае, когда "нам нужна победа и мы за ценой не постоим". umnik.gif


Так, а как Вам аргумент "так ведь такман работает же!". Т.е. такманами вполне неплохо, со всем тем комфортом, что обеспечивает такман-технология обнаруживают те же ДНК вирусов гепатита В в концентрации от 15 копий на миллилитр. Кстати, поясните плиз, что есть аббревиатура "ЛНА" - лоу нойз?
-Ъ-, 02.05.2012 13:40
http://en.wikipedia.org/wiki/Low-noise_amplifier lol.gif
А как длина ампликона "влияет" на ТакМан, надеюсь, понятно? wink.gif
-Ъ-, 02.05.2012 13:57
(Агроном @ 02.05.2012 09:09)
Ссылка на исходное сообщение  Так, а как Вам аргумент "так ведь такман работает же!". Т.е. такманами вполне неплохо, со всем тем комфортом, что обеспечивает такман-технология обнаруживают те же ДНК вирусов гепатита В в концентрации от 15 копий на миллилитр. Кстати, поясните плиз, что есть аббревиатура "ЛНА" - лоу нойз?

Кстати, эта заслуга не ТакМана, а способа выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки) yes.gif
Агроном, 02.05.2012 14:24
Кстати, эта заслуга не ТакМана, а способа выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки)


А нужны примеры сферического такмана в вакууме? :-) Кажется мы возвращаемся к "велосипеду", что каждая реакция ПЦР должна быть индивидуально оптимизирована и я в общем то не вижу причин не пользоваться такманом для тех целей, где он подходит.


выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки)

Кстати, что косвенно свидетельствует о специфичности методики, ибо куча посторонней ДНК присутствует.
-Ъ-, 02.05.2012 14:49
(Агроном @ 02.05.2012 15:24)
Ссылка на исходное сообщение  А нужны примеры сферического такмана в вакууме? :-) Кажется мы возвращаемся к "велосипеду", что каждая реакция ПЦР должна быть индивидуально оптимизирована и я в общем то не вижу причин не пользоваться такманом для тех целей, где он подходит.
Кстати, что косвенно свидетельствует о специфичности методики, ибо куча посторонней ДНК присутствует.

Нет, не нужны - все интересное стараюсь не пропускать.
Косвенно тоже не свидетельствует, т.к. в плазме и сыворотке оооочень мало ДНК, выделяй хоть из10 мл и наносите все содержимое в реакцию..
RNK, 03.05.2012 12:32
Используйте Phire Hot Start II DNA Polymerase:

Phire Hot Start II DNA Polymerase is not sensitive to any contamination, although more expensive than conventional Taq-polymerase, but this Phire Hot Start II DNA Polymerase should be taken 5 times less than the recommended concentration in the reaction.

http://www.finnzymes.com/pcr/phire_hot_sta...polymerase.html



http://www.finnzymes.com/directpcr/
yelena, 02.10.2012 15:48
Прошу прощения, я первый раз на форуме. Уважаемые коллеги, может быть кто-то дать совет. Мы подбираем схему амплификации для гена миостатина (амплификактор AMPLY 4, БиоКом, Россия). Длина амплификата ожидается больше 200. В некоторых наших опытных схемах идёт амплификация, но на уровне 50. Т.е. какая-то неспецифика амплифицируется, вместо нужного нам участка. Может у вас была подобная проблема, и вы как-то её решили. Подскажите, пожалуйста.
VKV, 02.10.2012 17:15
Ну просто не могу удержаться, чтобы еще раз не привести этот классический текст:

"... "Дорогие ученые. У меня который год в подполе происходит подземный стук. Объясните, пожалуйста, как он происходит". Система нужна..."
А&Б. Стругацкие

А теперь по делу: чтобы ответить на вопрос нужны подробности: что за матрица, какие праймеры, какой цикл, какая полимераза, какой размер ПЦР продукта (200 чего ???? тпн - сомневаюсь что-то, 200 пн ???), для чего вы делаете этот ПЦР и т.д. и т.п.
RJ Dio, 02.10.2012 17:50
На AMPLY 4, БиоКом, все равно какой режим ставить. Результат не изменится. Попробуйте приспособить сей агрегат для испекания оладий, к примеру
VKV, 02.10.2012 17:58
Вообще-то, при такой длине продукта, абсолютно все равно какая ПЦР машина.
yelena, 03.10.2012 12:13
Спасибо за внимание. Цель нашей работы - изучение полиморфизма гена миостатина овец. ДНК выделено из крови овец. Мы хотим амплифицировать фрагмент этого гена для последующей его рестрикции как указано в источнике:
P. L. Johnson, K. G. Dodds, W. E. Bain at al
Investigations into the GDF8 polymorphism in New Zealand Texel sheep g+6273G-A ( J Anim Sci published online Feb 27,2009). Праймеры взяты из этого же источника
Forward: 5’GTTCGTGATGGCTGTATAACG 3’; Reverse: 5’GTTAAATAAACTAATTGTTTTAGGACT 3’
В статье не были указаны условия амплификации, и авторы, к сожалению, не ответили, поэтому мы подбираем сами. Цикл: 94 (3 мин); 94 (60 сек), 60 (60 сек), 72 (60 сек) - 35 циклов; 72 (4 мин). Длина амплификата должна быть больше 200 п.н. Используем tag полимеразу 5000 u/ml SibEnzyme.
Ряд наших схем были неудачными, были полосы только на уровне праймеров. А некоторые схемы дали результат - 2 полосы - 1 - в районе праймеров, вторая - выше, на уровне 50.
AMPLY 4, БиоКом - пользуемся, тем что есть)
Возможно, вы с такой проблемой сталкивались? Почему амплифицируется какой-то неспецифический участок вместо нужного фрагмента?
Nett, 03.10.2012 12:41
Вы праймеры бластили или на данайцев понадеялись? Не верьте данайцам smile.gif
По минуте отжиг-элонгация даже в терцик-like машинах не самый хороший вариант.
-Ъ-, 03.10.2012 13:42
(yelena @ 03.10.2012 13:13)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо за внимание. Цель нашей работы -  изучение полиморфизма гена миостатина овец. ДНК выделено из крови овец. Мы хотим амплифицировать фрагмент этого гена для  последующей его рестрикции как указано в источнике:
P. L. Johnson, K. G. Dodds, W. E. Bain at al
Investigations into the GDF8  polymorphism in New Zealand Texel sheep g+6273G-A   ( J Anim Sci published online Feb 27,2009). Праймеры взяты из этого же источника
Forward: 5’GTTCGTGATGGCTGTATAACG 3’; Reverse: 5’GTTAAATAAACTAATTGTTTTAGGACT 3’
В статье не были указаны условия амплификации, и авторы, к сожалению, не ответили, поэтому мы подбираем сами. Цикл: 94 (3 мин); 94 (60 сек), 60 (60 сек), 72 (60 сек) - 35 циклов; 72 (4 мин). Длина амплификата должна быть больше 200 п.н. Используем tag полимеразу 5000 u/ml SibEnzyme.
Ряд наших схем были неудачными, были полосы только на уровне праймеров. А некоторые схемы дали результат - 2 полосы - 1 - в районе праймеров, вторая - выше, на уровне 50.
AMPLY 4, БиоКом - пользуемся, тем что есть)
Возможно, вы с такой проблемой сталкивались? Почему амплифицируется какой-то неспецифический участок вместо нужного фрагмента?


Семь раз примерь, один раз атрэж

>gb|JN856489.1| Ovis aries myostatin variant 2 (MSTN) gene, 3' UTR
Length=696

Score = 38.2 bits (19), Expect = 0.41
Identities = 19/19 (100%), Gaps = 0/19 (0%)
Strand=Plus/Plus

Query 1 GTTCGTGATGGCTGTATAA 19
|||||||||||||||||||
Sbjct 59 GTTCGTGATGGCTGTATAA 77
А по второму прайру вообще атас - все что угодно, только не бараны. eek.gif
yelena, 03.10.2012 15:55
Праймеры не бластили, понадеялись на статью. А вы через GeneBank праймеры проверили?
-Ъ-, 03.10.2012 16:37
(yelena @ 03.10.2012 16:55)
Ссылка на исходное сообщение  Праймеры не бластили, понадеялись на статью. А вы  через GeneBank праймеры проверили?

yes.gif
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
VKV, 03.10.2012 16:55
Не знаю, что там в бласте... может не все последовательности там представлены...
Но вот что я нашел: если использовать Vector NTI для расчета Tm ваших праймеров, то у первого - 50 оС, а у второго - 46,7 оС. То есть, я бы для отжига использовал 45 оС. Попробуйте, а если будет много неспецифики - увеличьте температуру. Лучше, конечно градиент поставить, если он на вашей машине поддерживается.
Кстати, еще 1н вопрос: вы на вашей ДНК еще какие-нибудь ПЦР ы ставили? С проверенными праймерами, который точно должен получиться....
-Ъ-, 03.10.2012 17:59
(VKV @ 03.10.2012 17:55)
Ссылка на исходное сообщение  Не знаю, что там в бласте... может не все последовательности там представлены...
Но вот что я нашел: если использовать Vector NTI для расчета Tm ваших праймеров, то у первого - 50 оС, а у второго - 46,7 оС. То есть, я бы для отжига использовал 45 оС. Попробуйте, а если будет много неспецифики - увеличьте температуру. Лучше, конечно градиент поставить, если он на вашей машине поддерживается.
Кстати, еще 1н вопрос: вы на вашей ДНК еще какие-нибудь ПЦР ы ставили? С проверенными праймерами, который точно должен получиться....

А я бы Вас уволил с работы за профнепригодность. frown.gif
Guest, 04.10.2012 08:08
У Вас ус отклеился smile.gif
реверс на тирозинкиназе, форвард на искомом. Ну и чего вы хотите? Ищите более благонадёжную статью
yelena, 04.10.2012 10:42
Нет, с овцами раньше не работали, к сожалению. Только начали работу. Спасибо вам всем большое за советы, дорогие коллеги. Возможно, действительно, с праймерами проблема...
-Ъ-, 04.10.2012 11:00
Прямой - gttcgtgatggctgtataatg
Обратный - ctacacattagatgtaagaaata 295 bp
Т отж. от 50-55 оС
Если после рестрикции появится дополнительная полоса или же полосы не будут расходиться на агароз.геле, я не виноват.
Красным цветом - исправление, опечатка в статье или авторы статьи нахимичили ... Должно быть все нормально.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.