не подскажете какую полимеразу лучше использовать для ПЦР?
bklimovich, 01.09.2010 16:52
ну, исходя из вопроса могу порекомендовать термостабильную)) уточните вопрос: какого производителя или какой тип полимеразы или что то еще? какой ПЦР? рутинная амплификация/длинный ПЦР/точный ПЦР. от всего этого зависит ответ
-Ъ-, 02.09.2010 09:43
Очередной троллинг...
Guest, 02.09.2010 11:27
(-Ъ- @ 02.09.2010 09:43)
Очередной троллинг...
ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?
-Ъ-, 02.09.2010 12:35
(Guest @ 02.09.2010 12:27)
ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?
Берите то, что есть под рукой. Может быть под промоторные области спецполимеразы выпускаются , не знаю.
Guest, 02.09.2010 17:29
(Guest @ 02.09.2010 11:27)
ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?
Такара СпидСТАР ХС с хот-старт антителами
petr, 02.09.2010 17:39
(Guest @ 02.09.2010 09:27)
ну зачем так сразу?? нужно отПЦРить промотор из геномки для клонирования. так что лучше взять? думаю про Так, но может есть что позабористее?
Не заморачивайтесь, ПЦРьте обычным Тагом, если у Вас конечно промоторная область в пределах 2кило (обычно меньше).
-Ъ-, 02.09.2010 22:05
(Guest @ 02.09.2010 18:29)
Такара СпидСТАР ХС с хот-старт антителами
А раньше антитела игнорировал...
mrotzek, 02.09.2010 22:49
(-Ъ- @ 02.09.2010 23:05)
А раньше антитела игнорировал...
да ладно антитела хороши если прямо с коровьего говна и в ПЦР на псевдотуберкулез - а если твоими магнитными шариками - я честно ТакМан по прописи )))))))))))) 40 циклов 95-60 градусов -ампликоны 70-90bp Как русские классики ТакМан ПЦР учут )))))))))))))
-Ъ-, 03.09.2010 10:04
(mrotzek @ 02.09.2010 23:49)
да ладно антитела хороши если прямо с коровьего говна и в ПЦР на псевдотуберкулез -
Дк, это же самое главное в жизни...
-Ъ-, 03.09.2010 10:07
(mrotzek @ 02.09.2010 23:49)
а если твоими магнитными шариками - я честно ТакМан по прописи )))))))))))) 40 циклов 95-60 градусов -ампликоны 70-90bp Как русские классики ТакМан ПЦР учут )))))))))))))
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
mrotzek, 03.09.2010 19:28
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
уболтал норвежские магнитные шарики регулярно ингибируют вирус ПЦР диагностику при 10-50 нанограмм на 20 мкл реалтайм ПЦР с ТакМанами и СИБР на АБИ Степане-48 и Степане-96 , кстати центрифужные микроспин киты Квакагена, Роша и прочих "умельцев" на "стеклянных бумажках" тоже не лучше перехажу нахрен взад на этанол-хлороформ задолбали уже
mrotzek, 03.09.2010 19:42
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
я более 20 лет ПЦРю 50 нанограм фенол-хлорофом ДНК на 20 миклов реакцию и проблем не имел чето того в "датском каралевстве " принц Гамлет ))
mrotzek, 03.09.2010 19:58
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
ты свои шарики проверь в паралель с "голден стандарт фенол-хлороформ"
mrotzek, 03.09.2010 20:09
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
делай стандартный фенол-хлорофом для контроля
mrotzek, 03.09.2010 20:18
стандартный кит для выделения днк методом сорбции на "стекло" на рынке стоит примерно 2-5 евро на образец - все киты всех компаний говно и по чувсвительности хуже , чем классичесский "фенол-хлороформ" Анализ современного рынка ПЦР ))))))))))))
mrotzek, 03.09.2010 20:30
(-Ъ- @ 03.09.2010 11:07)
Ты мои магнитные шарики еще не видел. Испытаешь когда-нибудь - тогда и скажешь "своЁ мнение".
для геномного сиквинирования чиловека я южу ДНК выделенную тока классическим "фенол-хлороформом" )))))))))))))
Yuri K, 04.09.2010 00:02
И как же это у тебя Тм гуляет плюс-минус 5 градусов после Ф-Х?! Я в растерянности.
Ты опять фишку не сечешь и сравниваешь яблоки с апельсинами.
ПЦР напрямую с защечных мазков, обработанных эпицентровским набором (там, ИМХО, Протеиназа К) идет прекрасно. Т е если образец нужен для ПЦР (напр., генотипирование), не надо ни стеклянных бумажек, ни шариков. Берешь мазки, греешь с Раствором Номер 1 по протоколу, потом храняться год при -20 (дольше не проверял). Сиквенс не делал, но ИМХО если так ПЦР идет, проблем не будет.
Если тебе нужно 10 лет один образец пользовать, т е нужна тонна ДНКи одного донора, тогда Кровь, Фенол и Хлороформ. Но много мелких образцов (напр, плазмидные минипрепы) фенолить задолбаешься, поэтому тут народ пользует разные колонки с силикатами, и правильно делает.
А шарики, это хайсрупут анализ мочи и прочего кала из задниц на патогены.
Короче, каждому свое.
mrotzek, 04.09.2010 01:22
(Yuri K @ 04.09.2010 01:02)
И как же это у тебя Тм гуляет плюс-минус 5 градусов после Ф-Х?! Я в растерянности.
Ты опять фишку не сечешь и сравниваешь яблоки с апельсинами.
ПЦР напрямую с защечных мазков, обработанных эпицентровским набором (там, ИМХО, Протеиназа К) идет прекрасно. Т е если образец нужен для ПЦР (напр., генотипирование), не надо ни стеклянных бумажек, ни шариков. Берешь мазки, греешь с Раствором Номер 1 по протоколу, потом храняться год при -20 (дольше не проверял). Сиквенс не делал, но ИМХО если так ПЦР идет, проблем не будет.
Если тебе нужно 10 лет один образец пользовать, т е нужна тонна ДНКи одного донора, тогда Кровь, Фенол и Хлороформ. Но много мелких образцов (напр, плазмидные минипрепы) фенолить задолбаешься, поэтому тут народ пользует разные колонки с силикатами, и правильно делает.
А шарики, это хайсрупут анализ мочи и прочего кала из задниц на патогены.
Короче, каждому свое.
Юр - я всегда верил в твою мудрость но споры бактерий в кале без беад-беатера не рушатся Привет жене и детям
Yuri K, 07.09.2010 17:06
(mrotzek @ 04.09.2010 01:22)
Юр - я всегда верил в твою мудрость но споры бактерий в кале без беад-беатера не рушатся Привет жене и детям
Ну лизис это типа отдельный вопрос. Еще одно приложение для шариков, кстати, это анализ разного рода цитологических образцов, загаженных альдегидами или просто сильно разбавленных, как моча (РС, ШурПасс етц.). Не будешь же ты фенолить мочу напрямую? Никакого фенола не хватит на такие объемы. В общем, метод определяется типом исходного материала и объемом проекта.
Сергей)), 22.04.2012 08:15
Подскажите пожалуйста, в чем особенностей TaqMan пцр? Если не сложно опишите методику=)))
Подскажите пожалуйста, в чем особенностей TaqMan пцр? Если не сложно опишите методику=)))
В том, что используется две активности одного фермента - Так-полимеразы - полимеразная и 5-штрих экзонуклеазная. Или другими словами, никтранслязная активность полимеразы, которая расшивает Пробу, блокированную с 3-штрих конца......... Это самый нечувствительный метод из известных методов Реал тайм ПЦР детекции. , которым весь мир тупо пользуется, глядя друг на друга.
Агроном, 26.04.2012 09:55
(-Ъ- @ 23.04.2012 18:40)
В том, что используется две активности одного фермента - Так-полимеразы - полимеразная и 5-штрих экзонуклеазная. Или другими словами, никтранслязная активность полимеразы, которая расшивает Пробу, блокированную с 3-штрих конца......... Это самый нечувствительный метод из известных методов Реал тайм ПЦР детекции. , которым весь мир тупо пользуется, глядя друг на друга.
Нуу, зато мультиплексность, еще большая специфичность... что я еще забыл? А! Претензии на колличественность проводимого анализа. Чувствительность - ей жертвовать приходится. Хотя недавно видел презентацию новой методики ПЦР-РТ, в которой ПЦР-реакция такмановская проходит в микрокаплях, флюоресценция считывается с каждой капли отдельно, чем достигается чувствительность до обнаружения 1 матрицы в пробе (цитируя разработчиков системы).
-Ъ-, 27.04.2012 10:43
(Агроном @ 26.04.2012 10:55)
Нуу, зато мультиплексность, еще большая специфичность... что я еще забыл? А! Претензии на колличественность проводимого анализа. Чувствительность - ей жертвовать приходится. Хотя недавно видел презентацию новой методики ПЦР-РТ, в которой ПЦР-реакция такмановская проходит в микрокаплях, флюоресценция считывается с каждой капли отдельно, чем достигается чувствительность до обнаружения 1 матрицы в пробе (цитируя разработчиков системы).
Специфичность - основная фишка ТакМана, которой машут манагеры, рекламируя реал тайм киты на ТакМанах. А на самом деле термин "специфичность" механически перенесен из гибридизационных доПЦР-ных методов (дот- и соузернов...). Но применительно к ТакМанам никто не задумывается над тем, как может обеспечить специфичность Проба, имеющая температуру плавления на 10 оС (!!!) (пусть даже на 5) выше чем у родных праймеров А если выровнить Т пл. - прощай чувствительность вместе со "специфичностью! Нет непосредственного контакта тушителя с источником - этим многое сказано. А что делать, если размер ПЦР продукта около 50? и т д. и т п... ТакМаны - раздутый мыльный пузырб от Аплайда.
Агроном, 27.04.2012 12:21
(-Ъ- @ 27.04.2012 11:43)
Специфичность - основная фишка ТакМана, которой машут манагеры, рекламируя реал тайм киты на ТакМанах. А на самом деле термин "специфичность" механически перенесен из гибридизационных доПЦР-ных методов (дот- и соузернов...). Но применительно к ТакМанам никто не задумывается над тем, как может обеспечить специфичность Проба, имеющая температуру плавления на 10 оС (!!!) (пусть даже на 5) выше чем у родных праймеров А если выровнить Т пл. - прощай чувствительность вместе со "специфичностью! Нет непосредственного контакта тушителя с источником - этим многое сказано. А что делать, если размер ПЦР продукта около 50? и т д. и т п... ТакМаны - раздутый мыльный пузырб от Аплайда.
Значицца так, по-порядку. 1) Температура плавления пробы естественно гораздо выше, ибо ДНК геномная длинна и не счесть связей водородных, скрепляющих цепи ее в горе и радости, пока денатурация на разлучит их. Температура плавления...эээ.. праймеров? Ладно, заменим на логически подходящее понятие "температура плавления пары матрица-праймер", так вот - эта температура ниже гораздо, так как праймер короток. Снизили мы температуру смеси до порога плавления пары праймера с матрицей, часть цепоцек ДНК ренатурировало, часть соединилась с праймерами. Пошла реакция полимеризации там, где прилипли праймеры, та часть что ренатурировала осталась как была. Вроде все специфично! А тут еще зонд. Зонд тоже должен специфически прилепиться. Итого мы имеем 4 специфические последовательности, которые должны совпасть - 2 праймера и 2 зонда. 2) Зонды меченные тушителем и флюорохромом короткие. Причем тут вообще размер ампликонов?
-Ъ-, 27.04.2012 15:32
Откуда второй зонд появился в такман-системе? О резонансных зондах я пока помалкиваю, пока о ТакМане. Специфичность от ТакМана - масло масленное, которое только ограничивает возможности Его Величества PCR. А сопливое соотношение сигнала к фону - вообще атас!.
А в жизни приходится иметь дело и с оооочень короткими ПЦР продуктами, и меньше 50 бп. Даже MGB с LNA тут не спасет.
Агроном, 28.04.2012 07:57
(-Ъ- @ 27.04.2012 16:32)
Откуда второй зонд появился в такман-системе? О резонансных зондах я пока помалкиваю, пока о ТакМане. Специфичность от ТакМана - масло масленное, которое только ограничивает возможности Его Величества PCR. А сопливое соотношение сигнала к фону - вообще атас!.
А в жизни приходится иметь дело и с оооочень короткими ПЦР продуктами, и меньше 50 бп. Даже MGB с LNA тут не спасет.
Нет, ну вообще то да, мне кажется суть спора сводится к тому, что в зависимости от целей лучше использовать разные методики. Такман весьма хорош для определенных задач. Поясните пожалуйста, как длина ампликонов влияет на такман?
guest: -Ъ- , 01.05.2012 16:13
(Агроном @ 28.04.2012 07:57)
Нет, ну вообще то да, мне кажется суть спора сводится к тому, что в зависимости от целей лучше использовать разные методики. Такман весьма хорош для определенных задач. Поясните пожалуйста, как длина ампликонов влияет на такман?
Согласитесь, на троих сообразить на кусочке длиной 50 пн сложновато! Можно конечно, но в том случае, если на 100% LNA-зировать все олиги, или же катионизировать пробу спермином. Но это в крайнем случае, когда "нам нужна победа и мы за ценой не постоим".
Агроном, 02.05.2012 08:09
(guest: -Ъ- @ 01.05.2012 17:13)
Согласитесь, на троих сообразить на кусочке длиной 50 пн сложновато! Можно конечно, но в том случае, если на 100% LNA-зировать все олиги, или же катионизировать пробу спермином. Но это в крайнем случае, когда "нам нужна победа и мы за ценой не постоим".
Так, а как Вам аргумент "так ведь такман работает же!". Т.е. такманами вполне неплохо, со всем тем комфортом, что обеспечивает такман-технология обнаруживают те же ДНК вирусов гепатита В в концентрации от 15 копий на миллилитр. Кстати, поясните плиз, что есть аббревиатура "ЛНА" - лоу нойз?
Так, а как Вам аргумент "так ведь такман работает же!". Т.е. такманами вполне неплохо, со всем тем комфортом, что обеспечивает такман-технология обнаруживают те же ДНК вирусов гепатита В в концентрации от 15 копий на миллилитр. Кстати, поясните плиз, что есть аббревиатура "ЛНА" - лоу нойз?
Кстати, эта заслуга не ТакМана, а способа выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки)
Агроном, 02.05.2012 14:24
Кстати, эта заслуга не ТакМана, а способа выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки)
А нужны примеры сферического такмана в вакууме? :-) Кажется мы возвращаемся к "велосипеду", что каждая реакция ПЦР должна быть индивидуально оптимизирована и я в общем то не вижу причин не пользоваться такманом для тех целей, где он подходит.
выделения ДНК из БОЛЬШОГО объема плазмы (сываротки)
Кстати, что косвенно свидетельствует о специфичности методики, ибо куча посторонней ДНК присутствует.
-Ъ-, 02.05.2012 14:49
(Агроном @ 02.05.2012 15:24)
А нужны примеры сферического такмана в вакууме? :-) Кажется мы возвращаемся к "велосипеду", что каждая реакция ПЦР должна быть индивидуально оптимизирована и я в общем то не вижу причин не пользоваться такманом для тех целей, где он подходит. Кстати, что косвенно свидетельствует о специфичности методики, ибо куча посторонней ДНК присутствует.
Нет, не нужны - все интересное стараюсь не пропускать. Косвенно тоже не свидетельствует, т.к. в плазме и сыворотке оооочень мало ДНК, выделяй хоть из10 мл и наносите все содержимое в реакцию..
RNK, 03.05.2012 12:32
Используйте Phire Hot Start II DNA Polymerase:
Phire Hot Start II DNA Polymerase is not sensitive to any contamination, although more expensive than conventional Taq-polymerase, but this Phire Hot Start II DNA Polymerase should be taken 5 times less than the recommended concentration in the reaction.
Прошу прощения, я первый раз на форуме. Уважаемые коллеги, может быть кто-то дать совет. Мы подбираем схему амплификации для гена миостатина (амплификактор AMPLY 4, БиоКом, Россия). Длина амплификата ожидается больше 200. В некоторых наших опытных схемах идёт амплификация, но на уровне 50. Т.е. какая-то неспецифика амплифицируется, вместо нужного нам участка. Может у вас была подобная проблема, и вы как-то её решили. Подскажите, пожалуйста.
VKV, 02.10.2012 17:15
Ну просто не могу удержаться, чтобы еще раз не привести этот классический текст:
"... "Дорогие ученые. У меня который год в подполе происходит подземный стук. Объясните, пожалуйста, как он происходит". Система нужна..." А&Б. Стругацкие
А теперь по делу: чтобы ответить на вопрос нужны подробности: что за матрица, какие праймеры, какой цикл, какая полимераза, какой размер ПЦР продукта (200 чего ???? тпн - сомневаюсь что-то, 200 пн ???), для чего вы делаете этот ПЦР и т.д. и т.п.
RJ Dio, 02.10.2012 17:50
На AMPLY 4, БиоКом, все равно какой режим ставить. Результат не изменится. Попробуйте приспособить сей агрегат для испекания оладий, к примеру
VKV, 02.10.2012 17:58
Вообще-то, при такой длине продукта, абсолютно все равно какая ПЦР машина.
yelena, 03.10.2012 12:13
Спасибо за внимание. Цель нашей работы - изучение полиморфизма гена миостатина овец. ДНК выделено из крови овец. Мы хотим амплифицировать фрагмент этого гена для последующей его рестрикции как указано в источнике: P. L. Johnson, K. G. Dodds, W. E. Bain at al Investigations into the GDF8 polymorphism in New Zealand Texel sheep g+6273G-A ( J Anim Sci published online Feb 27,2009). Праймеры взяты из этого же источника Forward: 5’GTTCGTGATGGCTGTATAACG 3’; Reverse: 5’GTTAAATAAACTAATTGTTTTAGGACT 3’ В статье не были указаны условия амплификации, и авторы, к сожалению, не ответили, поэтому мы подбираем сами. Цикл: 94 (3 мин); 94 (60 сек), 60 (60 сек), 72 (60 сек) - 35 циклов; 72 (4 мин). Длина амплификата должна быть больше 200 п.н. Используем tag полимеразу 5000 u/ml SibEnzyme. Ряд наших схем были неудачными, были полосы только на уровне праймеров. А некоторые схемы дали результат - 2 полосы - 1 - в районе праймеров, вторая - выше, на уровне 50. AMPLY 4, БиоКом - пользуемся, тем что есть) Возможно, вы с такой проблемой сталкивались? Почему амплифицируется какой-то неспецифический участок вместо нужного фрагмента?
Nett, 03.10.2012 12:41
Вы праймеры бластили или на данайцев понадеялись? Не верьте данайцам По минуте отжиг-элонгация даже в терцик-like машинах не самый хороший вариант.
-Ъ-, 03.10.2012 13:42
(yelena @ 03.10.2012 13:13)
Спасибо за внимание. Цель нашей работы - изучение полиморфизма гена миостатина овец. ДНК выделено из крови овец. Мы хотим амплифицировать фрагмент этого гена для последующей его рестрикции как указано в источнике: P. L. Johnson, K. G. Dodds, W. E. Bain at al Investigations into the GDF8 polymorphism in New Zealand Texel sheep g+6273G-A ( J Anim Sci published online Feb 27,2009). Праймеры взяты из этого же источника Forward: 5’GTTCGTGATGGCTGTATAACG 3’; Reverse: 5’GTTAAATAAACTAATTGTTTTAGGACT 3’ В статье не были указаны условия амплификации, и авторы, к сожалению, не ответили, поэтому мы подбираем сами. Цикл: 94 (3 мин); 94 (60 сек), 60 (60 сек), 72 (60 сек) - 35 циклов; 72 (4 мин). Длина амплификата должна быть больше 200 п.н. Используем tag полимеразу 5000 u/ml SibEnzyme. Ряд наших схем были неудачными, были полосы только на уровне праймеров. А некоторые схемы дали результат - 2 полосы - 1 - в районе праймеров, вторая - выше, на уровне 50. AMPLY 4, БиоКом - пользуемся, тем что есть) Возможно, вы с такой проблемой сталкивались? Почему амплифицируется какой-то неспецифический участок вместо нужного фрагмента?
Не знаю, что там в бласте... может не все последовательности там представлены... Но вот что я нашел: если использовать Vector NTI для расчета Tm ваших праймеров, то у первого - 50 оС, а у второго - 46,7 оС. То есть, я бы для отжига использовал 45 оС. Попробуйте, а если будет много неспецифики - увеличьте температуру. Лучше, конечно градиент поставить, если он на вашей машине поддерживается. Кстати, еще 1н вопрос: вы на вашей ДНК еще какие-нибудь ПЦР ы ставили? С проверенными праймерами, который точно должен получиться....
-Ъ-, 03.10.2012 17:59
(VKV @ 03.10.2012 17:55)
Не знаю, что там в бласте... может не все последовательности там представлены... Но вот что я нашел: если использовать Vector NTI для расчета Tm ваших праймеров, то у первого - 50 оС, а у второго - 46,7 оС. То есть, я бы для отжига использовал 45 оС. Попробуйте, а если будет много неспецифики - увеличьте температуру. Лучше, конечно градиент поставить, если он на вашей машине поддерживается. Кстати, еще 1н вопрос: вы на вашей ДНК еще какие-нибудь ПЦР ы ставили? С проверенными праймерами, который точно должен получиться....
А я бы Вас уволил с работы за профнепригодность.
Guest, 04.10.2012 08:08
У Вас ус отклеился реверс на тирозинкиназе, форвард на искомом. Ну и чего вы хотите? Ищите более благонадёжную статью
yelena, 04.10.2012 10:42
Нет, с овцами раньше не работали, к сожалению. Только начали работу. Спасибо вам всем большое за советы, дорогие коллеги. Возможно, действительно, с праймерами проблема...
-Ъ-, 04.10.2012 11:00
Прямой - gttcgtgatggctgtataatg Обратный - ctacacattagatgtaagaaata 295 bp Т отж. от 50-55 оС Если после рестрикции появится дополнительная полоса или же полосы не будут расходиться на агароз.геле, я не виноват. Красным цветом - исправление, опечатка в статье или авторы статьи нахимичили ... Должно быть все нормально.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.