Поздравляю всех молекулярных (и не только) биологов с Днём ДНК!
А, 04.05.2012 08:33
(Guest @ 13.04.2012 06:27)
я пока на МисеКа деньги откладую ну его нафик "емулшн ПЦР"
а скажите пожалуйста, чем плоха эмульсионная ПЦР и какие преимущества у MySeq при подготовке библиотеки?
genseq, 04.05.2012 19:00
Эмульсионная ПЦР плоха тем, что её нужно проводить, причём в отдельном аппарате (Ion OneTouch™ System), а у MiSeq "всё включено". Последнее выглядит очень привлекательно для наиболее тупых пользователей. Но дело не только в тупости. Выращивание молекулярных кластеров in situ действительно более прогрессивно. Со временем на него переключится и полупроводниковая технология, но пока это не планируется даже у Ion Proton.
Только учтите, что для наших людей главное не прогрессивность, а цена. Нынешняя технология получение кластеров сжирает слишком много дорогих реагентов, и пока она стоит дороже эмульсионной пробоподготовки.
Что касается подготовки библиотеки, то особой разницы нет.
mlog, 04.05.2012 22:42
(genseq @ 04.05.2012 20:00)
Только учтите, что для наших людей главное не прогрессивность, а цена. Нынешняя технология получение кластеров сжирает слишком много дорогих реагентов, и пока она стоит дороже эмульсионной пробоподготовки.
Я видела цены и на то, и на другое - и поэтому позволю себе не согласиться. Реагенты для майсека (там сиквенсные и кластерные объединены в один кит) на 300 циклов стоят порядка 2 тысяч $. Для Иона больше 2 тысяч тех же единиц стоит один только набор для эмульсионной ПЦР. А ещё же нужен и сиквенсный кит и чипы.
Guest, 05.05.2012 08:41
(mlog @ 04.05.2012 22:42)
Я видела цены и на то, и на другое - и поэтому позволю себе не согласиться. Реагенты для майсека (там сиквенсные и кластерные объединены в один кит) на 300 циклов стоят порядка 2 тысяч $. Для Иона больше 2 тысяч тех же единиц стоит один только набор для эмульсионной ПЦР. А ещё же нужен и сиквенсный кит и чипы.
У MiSeq 2 тыс.$ - это,похоже, на один запуск. И без стоимости одноразовой проточной ячейки. Если не ошибаюсь, один запуск PGM (без emPCR) стоит меньше 200$ (99$ Ion 314 + 75$ dNTP). Набор для emPCR, рассчитанный подготовку 10 препаратов, стоит 1250$: https://products.invitrogen.com/ivgn/product/4468660 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/4471263 Т.е. реагенты для подготовки 1 препарата при помощи emPCR стоят 125$.
The Ion OneTouch™ 200 Template Kit contains template preparation reagents for sequencing 10 samples using the Ion OneTouch™ System. The kit components include proprietary Ion Sphere™ particles, buffers, PCR reagent and enzyme mixes, consumables, and primers.
Guest, 05.05.2012 09:43
Скажите, пожалуйста, что вы думаете вот о чем. Много лет мне очень не хватает необременительного компактного настольного секвенатора на 1 условный капилляр. Бывает надо что-то очень быстро сделать. Это мне только такое надо или есть у кого-то еще интерес к такому прибору?
mlog, 05.05.2012 11:04
(Guest @ 05.05.2012 09:41)
У MiSeq 2 тыс.$ - это,похоже, на один запуск. И без стоимости одноразовой проточной ячейки.
Нет, это включает стоимость ячейки: MiSeq Reagent Kit The MiSeq Reagent Kit includes all of the reagents needed for cluster generation and sequencing on the MiSeq system. Pre-filled, ready-to-use reagents are provided in a unique, single-use cartridge, enabling the easiest next-generation sequencing workflow. In addition, the MiSeq Reagent Kit contains a MiSeq flow cell and additional buffers supporting hybridization and nucleotide incorporation.
Если не ошибаюсь, один запуск PGM (без emPCR) стоит меньше 200$ (99$ Ion 314 + 75$ dNTP). Набор для emPCR, рассчитанный подготовку 10 препаратов, стоит 1250$: https://products.invitrogen.com/ivgn/product/4468660 http://products.invitrogen.com/ivgn/product/4471263 Т.е. реагенты для подготовки 1 препарата при помощи emPCR стоят 125$. The Ion OneTouch™ 200 Template Kit contains template preparation reagents for sequencing 10 samples using the Ion OneTouch™ System. The kit components include proprietary Ion Sphere™ particles, buffers, PCR reagent and enzyme mixes, consumables, and primers.
314 чип считать как-то несолидно (no pun intended), когда есть 318 Относительно числа препаратов - это же зависит от мультиплексирования. Наборы Nextera позволяют мультиплексирование до 96 образцов. Что насчёт Ion Torrent, честно, не знаю, какой там максимум? 24? Вообще, надо считать в центах за нуклеотид - самый надёжный показатель И на российские цены сразу пересчитывать.
mlog, 05.05.2012 11:05
(Guest @ 05.05.2012 10:43)
Скажите, пожалуйста, что вы думаете вот о чем. Много лет мне очень не хватает необременительного компактного настольного секвенатора на 1 условный капилляр. Бывает надо что-то очень быстро сделать. Это мне только такое надо или есть у кого-то еще интерес к такому прибору?
Большинство российских учёных работают в условиях, когда по пол-года ждут денег, и потом ещё по 3 месяца - реагентов. В таких условиях можно подождать и 3 дня вместо одного Так что если говорить про Россию, то вероятно, только Вам
Очень хорошо, какие прогнозы стоимости генома на начало 2013 года и 2014 года? Кстати, а у кого сейчас самый дешевый геном? Геном я понимаю геном человека (насколько я помню, первый геном стоил 3 миллиарда долларов, могу ошибаться в разы, но не пордяки) С уважением,
genseq, 22.05.2012 21:53
На начало 2013 года Ротберг обещал довести стоимость генома до 1000$, но мне что-то не верится. Скорее всего, до 1000$ цена опустится уже в 2014 году. Впрочем, смотря как считать. Если без накладных расходов и обработки данных, то Ротберг, возможно, прав.
apoptos, 22.05.2012 21:55
А какая при этом точность?
genseq, 23.05.2012 07:55
Точность - понятие растяжимое. Особенно при ресеквенировании хорошо изученного человеческого генома, когда вероятность совпадения небольших делеций и инсерций с длинными гомополимерными участками невысока. В этом случае ошибки при чтении гомополимеров не слишком существенны. Существеннее выявление CNV и различных перестроек, для которых нужно длинное и/или парноконцевое чтение. Последнее сейчас уже доступно и для полупроводниковых секвенаторов, причём средняя длина чтения у них перевалила за 200 п.о., а концу года должна увеличиться до 300 п.о.. Что касается "тупого" выявления новых снипов, то для него важнее "тупое" же увеличение кратности чтения. Обычно при расчётах ориентируются на 30-кратное чтение, но онкологи уже предпочитают 100-кратное. Производительность Ion Proton может добраться до 30-кратности, но 100-кратный уровень будет осваивать уже следующая модель, которая появится ещё не скоро. Года через два. Или даже через три.
vtosha, 08.06.2012 11:42
У NEBа вообще хорошие и устойчивые реагенты для пробоподготовки. Ещё, кстати, к вопросу о фрагментации: у NEB есть отдельная смесь ферментов, так и называется "фрагментаза" (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0348.asp). Стоит около трёх тысяч рублей в России. Преимущества: самый дешёвый выявленный способ фрагментации. Недостаток: с каждой новой ДНК нужно подбирать условия обработки.
Критика: "Собрать бактериальный геном можно из фрагментов длиной 20…22 п.о." Это очень и очень оптимистично.
genseq, 09.06.2012 09:06
(vtosha @ 08.06.2012 09:42)
У NEBа вообще хорошие и устойчивые реагенты для пробоподготовки. Ещё, кстати, к вопросу о фрагментации: у NEB есть отдельная смесь ферментов, так и называется "фрагментаза" (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0348.asp). Стоит около трёх тысяч рублей в России. Преимущества: самый дешёвый выявленный способ фрагментации. Недостаток: с каждой новой ДНК нужно подбирать условия обработки.
Критика: "Собрать бактериальный геном можно из фрагментов длиной 20…22 п.о." Это очень и очень оптимистично.
Насколько я понял, пузырёк фрагментазы, рассчитанный на обработку 50 проб, в каталоге NEB стоит 99$ и продаётся их дилером (СибЭнзим) за те же деньги (~3000 руб.). Т.е. фрагментация одного препарата ДНК может стоить ~2$. Ничего не имею против, но дешевле использовать ДНКазу, выделяемую в культуральную среду чудесной палочкой. В 70-х годах прошлого века у меня в холодильнике валялся пенициллиновый пузырёк с этой ДНКазой, произведённой, если не ошибаюсь, в Бердске. Уже не помню, сколько миллионов единиц там было. Помню, что много.
Что касается сборки бактериальных геномов из коротких (20...22 п.о.) фрагментов, то это не я придумал. Была такая публикация. Там биоинформатики развлекались построением графиков, отражающих зависимость полноты сборки геномов фага лямбда и E.coli от длины сиквенсов. Для фага уже при длине фрагментов 14 п.о. геном собирался на 100%. У колийного генома при длине фрагментов 20...22 п.о. сборка переваливала за 90% и дальше росла очень медленно. Мешали протяжённые повторы (гены rRNA и т.п.). Графики из этой статьи фигурировали в одном из моих ранних докладов, но это было так давно, что сейчас найти эту презентацию не смог.
vtosha, 09.06.2012 11:22
Обычные ДНКазы не используются - они режут с какими-то предпочтениями. Фирма утверждает, что фрагментаза режет без предпочтений, но никак это проверить мы не можем.
Про сборку бактериальных геномов - ну им сильно повезло, видимо. Мы уже и сами эти графики строить можем, у нас полный набор есть: 36, 36+36, 72+72, 100 +100. Так ведь и 100 + 100 в полный геном не собирает. Можно бы задуматься о предпочтении фрагментазы, так ведь и после Ковариса не собирает. А покрытие больше 800.
Guest, 09.06.2012 11:54
(genseq @ 09.06.2012 09:06)
Что касается сборки бактериальных геномов из коротких (20...22 п.о.) фрагментов, то это не я придумал. Была такая публикация. Там биоинформатики развлекались построением графиков, отражающих зависимость полноты сборки геномов фага лямбда и E.coli от длины сиквенсов. Для фага уже при длине фрагментов 14 п.о. геном собирался на 100%. У колийного генома при длине фрагментов 20...22 п.о. сборка переваливала за 90% и дальше росла очень медленно. Мешали протяжённые повторы (гены rRNA и т.п.). Графики из этой статьи фигурировали в одном из моих ранних докладов, но это было так давно, что сейчас найти эту презентацию не смог.
"Analysis of the reassembly of the E.coli genome show that with a read length of 20 nt, over 98% of the genome can be re-assembled into contigs larger than 100 nt, and 91% into contigs larger than 1000 nt. However, only 10% is covered by contigs larger than 10 000 nt."
Контиги по 1 Кб - это не сборка
genseq, 09.06.2012 14:44
Она самая. Особенно хороши вот эти графики:
Картинки: 14_20.JPG — (31.78)
vtosha, 09.06.2012 15:42
А, ну n50 мы и на 36 получили около 3000 тысяч - на отдельные гены хватило, а на опероны уже нет. Но это не совсем то, чего хотелось бы в оптимуме.
mlog, 09.06.2012 16:04
(vtosha @ 09.06.2012 16:42)
А, ну n50 мы и на 36 получили около 3000 тысяч - на отдельные гены хватило, а на опероны уже нет. Но это не совсем то, чего хотелось бы в оптимуме.
А со 100+100 как получается?
vtosha, 09.06.2012 16:47
36+36 N50 было 10-30 тысяч. 72+72 N50 было 100 - 150 тысяч. Теперь 100 + 100 N50 300 - 500 тысяч. Размер генома - примерно 5,5 Мб (один - 7 Мб). При этом количество нодов 100 - 150, как и в прошлый раз было. Это только Velvet, больше пока ничем не пробовали.
Guest, 10.06.2012 17:30
ooo
-Ъ-, 11.06.2012 12:36
(vtosha @ 08.06.2012 12:42)
У NEBа вообще хорошие и устойчивые реагенты для пробоподготовки. Ещё, кстати, к вопросу о фрагментации: у NEB есть отдельная смесь ферментов, так и называется "фрагментаза" (http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0348.asp). Стоит около трёх тысяч рублей в России. Преимущества: самый дешёвый выявленный способ фрагментации. Недостаток: с каждой новой ДНК нужно подбирать условия обработки.Критика: "Собрать бактериальный геном можно из фрагментов длиной 20…22 п.о." Это очень и очень оптимистично.
А какие именно... Может проще подбирать условия каждый раз, если "фрагментазный" коктейль такой дешевый.
mlog, 11.06.2012 12:48
(-Ъ- @ 11.06.2012 13:36)
А какие именно... Может проще подбирать условия каждый раз, если "фрагментазный" коктейль такой дешевый.
особенно если ДНК уникальная и её 150 нг на всё про всё
genseq, 11.06.2012 13:15
Понедельник нынче выходной, но, похоже, все торчат на работе. Лично я отдыхаю за компьютером. Сейчас рассчитал праймеры для HLA-типирования - 11 пар для мультиплексной ПЦР. Перечень генов и экзонов такой же, как в рошевском наборе для HLA-типирования:
Проблема в том, что ампликоны довольно длинные (до 3 тыс.п.о.) и содержат тугоплавкие шпильки. Т.е. для амплификации нужно использовать исключительно сухие наборы для LD-PCR от -Ъ-, причём перед секвенированием ампликоны желательно порубить фрагментазой, а потом ещё пришить индексированные адапторы, чтобы типировать сразу по несколько десятков человек. Иначе получится дороговато. Сделать можно всё, но сначала нужно ответить на главный вопрос: а кому это нужно? За бугром такая потребность имеется. А у нас?
А какие именно... Может проще подбирать условия каждый раз, если "фрагментазный" коктейль такой дешевый.
Когда не ограничен в ДНК, то проще. Вариации могут быть по времени инкубации и по количеству фрагментазы. Производитель утверждает, что 100 мкл достаточно для 50 реакций, но в методике уточняет, что требуется по 2 мкл фрагментазы на 1 мкг ДНК, то есть если хочется брать пожирнее, по 5 мкг ДНК, то фрагментазы хватит только на 10 реакций. Впрочем, если её брать вполовину меньше требуемого, она всё равно работает. Можно сделать пробную калибровку (смешать сразу большой объём смеси, а потом отбирать через 5-10 минут по 5 мкл, взять 4-5 проб, а потом выбрать из них оптимальное время нарезки). Однако подбирать условия приходится практически к каждому образцу. Различия могут быть даже у очень близких штаммов, зависеть от разных способов выделения ДНК и от фаз луны. Поэтому если образцов под сотню (а такое бывает в случае максигеномных секвентаров), то коварис жизнь облегчает и удешевляет на много человеко-часов работы.
-Ъ-, 13.06.2012 10:13
(vtosha @ 11.06.2012 17:43)
Однако подбирать условия приходится практически к каждому образцу. Различия могут быть даже у очень близких штаммов, зависеть от разных способов выделения ДНК и от фаз луны. Поэтому если образцов под сотню (а такое бывает в случае максигеномных секвентаров), то коварис жизнь облегчает и удешевляет на много человеко-часов работы.
Я все понял. ...к каждому образцу
-Ъ-, 13.06.2012 10:27
(genseq @ 11.06.2012 14:15)
Сделать можно всё, но сначала нужно ответить на главный вопрос: а кому это нужно? За бугром такая потребность имеется. А у нас?
У нас тоже, конечно, есть такая потребность, но... Я как представитель "традиционных методов" (не секвенированием) HLA-типирования с начала 90-х, скажу что: 1. 10-15 лет назад киты не покупались - не на что было... 2. Сейчас их, денег, навалом и покупают от Инвитрогена или же Кайджина...
Guest, 13.06.2012 12:00
(mlog @ 11.06.2012 12:48)
особенно если ДНК уникальная и её 150 нг на всё про всё
У Маши геном не маленький, у Маши мало ДНК - шаг в сторону и нет такой ДНК на Зеиле... может быть.
mlog, 13.06.2012 22:23
(-Ъ- @ 13.06.2012 19:40)
У Маши геном не маленький, у Маши мало ДНК - шаг в сторону и нет такой ДНК на Зеиле... может быть.
Всё правильно излагаете!
Но надо понимать, что даже если кто-то из нас туда поедет, шанс собрать **** стремится к нулю - даже если растения в местах работ будут, обнаружить их можно только случайно.
- это цитата из письма коллеги, которого я спрашиваю, нельзя ли собрать ещё немного...
vtosha, 14.06.2012 09:23
-Ъ-, товарищ шутит и пытается подколоть. Думаю, от двух до четырёх сотен тысяч рублей за набор на 50-100 образцов. Индексы покупаются отдельно.
genseq, 17.06.2012 09:05
Четверг (14.06.2012). 12-00. Госдума. Круглый стол Экспертного совета по актуальным социально-экономическим и научно-техническим проблемам фракции ЛДПР. Тема - "Разработка отечественной технологии полупроводникового геномного секвенирования".
Витающий в воздухе запах дензнаков поспособствовал привлечению к этому мероприятию внимания нескольких видных учёных, а также множества непонятных личностей. Удалось несколько слов сказать в прениях. Счёл своим долгом поблагодарить организаторов круглого стола за привлечение внимания к этой проблеме, а главное - подбросил им идею проведения расширенных парламентских слушаний на тему "Состояние и перспективы развития генетических исследований в России", приуроченных к 60-летию Международного Дня ДНК (25 апреля 2013 г.).
Услышав про 25 апреля председатель собрания неожиданно оживился и заявил, что это день рождения Владимира Вольфовича. Последний взирал на происходящее с развешанных на стенах зала картин:
"Нам не дано предугадать, как наше слово отзовётся" (А.С.Пушкин)
-Ъ-, 18.06.2012 10:29
(vtosha @ 14.06.2012 10:23)
-Ъ-, товарищ шутит и пытается подколоть. Думаю, от двух до четырёх сотен тысяч рублей за набор на 50-100 образцов. Индексы покупаются отдельно.
Кстати, этого товарисча с несколькими АйПи я вычислил давно... хоть и аноним, но от него польза есть.
Guest, 18.06.2012 11:39
(-Ъ- @ 18.06.2012 10:29)
Кстати, этого товарисча с несколькими АйПи я вычислил давно...
тоже мне геном бином Ньютона
Guest, 19.06.2012 14:06
14 июня 2012 года состоялось совещание Экспертного совета по актуальным социально-экономическим и научно-техническим проблемам Государственной Думы РФ по проблеме «Разработка отечественной технологии полупроводникового геномного секвенирования», на котором доцент кафедры ИБС СГТУ имени Гагарина Ю.А. Алексей Мантуров представил доклад о создании перспективного программно-аппаратного комплекса для реконструкции первичной нуклеотидной последовательности ДНК.
На совещании присутствовали ведущие специалисты и руководители таких организаций, как Московский институт электронной техники (МИЭТ), ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН), Пущинский научный центр РАН, ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ЗАО «Зеленоградский нанотехнологический центр», МГУ им. М.В. Ломоносова и другие.
Guest, 19.06.2012 14:14
Аккредитуемые участники: Ф.И.О.: Мантуров Алексей Олегович Секция: электроника, микроэлектроника, приборостроение Презентация проекта на начальной стадии реализации (стартапа): нет Аккредитуемые участники (стартап): Описание инновационного проекта получено: нет Прицепной энергосберегающий плуг ПБС-12П к тракторам мощностью 370-550 л.с.
14 июня 2012 года состоялось совещание Экспертного совета по актуальным социально-экономическим и научно-техническим проблемам Государственной Думы РФ по проблеме «Разработка отечественной технологии полупроводникового геномного секвенирования», на котором доцент кафедры ИБС СГТУ имени Гагарина Ю.А. Алексей Мантуров представил доклад о создании перспективного программно-аппаратного комплекса для реконструкции первичной нуклеотидной последовательности ДНК.
На совещании присутствовали ведущие специалисты и руководители таких организаций, как Московский институт электронной техники (МИЭТ), ФГБУН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН), Пущинский научный центр РАН, ФГБУН Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, ЗАО «Зеленоградский нанотехнологический центр», МГУ им. М.В. Ломоносова и другие.
Вот до чего доигрался наш Генсек. подбивает страну на такие авантюры. Но это все равно в сто раз лучше чем развивать "стратегическую авиацию (бомбардировку)".
Guest, 19.06.2012 15:12
(-Ъ- @ 19.06.2012 15:10)
Вот до чего доигрался наш Генсек. подбивает страну на такие авантюры. Но это все равно в сто раз лучше чем развивать "стратегическую авиацию (бомбардировку)".
не знаю до чего он доигрался , но ион торрент японцы сделали в 1992
Anal Chem. 1992 Sep 1;64(17):1996-7. Real-time monitoring of DNA polymerase reactions by a micro ISFET pH sensor. Sakurai T, Husimi Y.
PMID: 1416046 [PubMed - indexed for MEDLINE]
Publication Types, MeSH Terms, Substances LinkOut - more resources
-Ъ-, 19.06.2012 15:17
(Guest @ 19.06.2012 16:12)
не знаю до чего он доигрался , но ион торрент японцы сделали в 1992
Anal Chem. 1992 Sep 1;64(17):1996-7. Real-time monitoring of DNA polymerase reactions by a micro ISFET pH sensor. Sakurai T, Husimi Y.
PMID: 1416046 [PubMed - indexed for MEDLINE]
Publication Types, MeSH Terms, Substances LinkOut - more resources
Ну и фиг с ними, с япошками и, к тому же, им сейчас не до жиру...
Guest, 19.06.2012 16:00
(-Ъ- @ 19.06.2012 15:10)
Вот до чего доигрался наш Генсек. подбивает страну на такие авантюры. Но это все равно в сто раз лучше чем развивать "стратегическую авиацию (бомбардировку)".
может на капиллярниках потренироватся ?
-Ъ-, 20.06.2012 10:15
Все эти япошки, корейцы и теперь китаёзы, все воровали и воруют... Даже "Техникой для молодежи" не брезговали, уроды! Пардон, день тяжелый ...
genseq, 16.07.2012 21:02
(Guest @ 19.06.2012 13:12)
не знаю до чего он доигрался , но ион торрент японцы сделали в 1992
Anal Chem. 1992 Sep 1;64(17):1996-7. Real-time monitoring of DNA polymerase reactions by a micro ISFET pH sensor. Sakurai T, Husimi Y.
Вот что говорится об этой работе японцев в историческом обзоре "Seuencing for all":
Задолго до англичан и американцев (в том числе индийского и иранского происхождения) изменение pH при включении нуклеотидов в ДНК регистрировали и японские учёные. По их расчетам при включении нуклеотидов в ДНК pH должна была не уменьшаться, а увеличиваться. Самое смешное то, что благодаря некоторым ошибкам в планировании опытов и в трактовке получаемых результатов им удалось получить эксперментальные доказательства правильности своих ошибочных расчётов.
Картинки:
Jp.JPG — (22.11)
-Ъ-, 17.07.2012 10:52
Кто в состоянии воспроизвести патент, тот способен легко обойти его, ИМХО.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.