http://flxlexblog.wordpress.com/2013/10/01...r-2013-edition/

генсек - интересная логика - почему у иллумины на картинке толко однокоцевые риды ?


for Illumina, I chose to use the single-end read length, although the maximum throughput was based on the sum of all reads from a paired end run; I felt it unfair to double the read length for this platform for the figure

Вопрос, конечно, интересный. Ответ на него дал автор картинки. К нему и обращайтесь за подробностями.


Вчера в Интернет-журнале "Биомика" появилась статья "Секвенирование по Ротбергу":
http://biomics.ru/nomera/2013/56-sekveniro...nirovaniya.html
Одновременно там же опубликован её англоязычный вариант ("Rothberg sequencing"):
http://biomics.ru/nomera/2013/57-rothberg-...sequencing.html

Буду признателен за любые замечания.

ну Мисек уж точно делает 450 бп после сшивки 2х250 бп парноконцевых ,
на 2х300 бп у мисека 550 бп (FLASH) , так что одноконцевики Юниор и Ион Торрент отдыхают

Юниор не отдыхает. Он сдох. А вот Ion Torrent, действительно, отдыхает. Но конкуренты долго отдохнуть не дадут. Через пару лет Рошевцы "выкатят" свой полупроводниковый секвенатор с увеличенной длиной чтения. Да и Ion Torrent, наверное, разродится очередной моделью с производительностью порядка 100 Gb и длиной чтения 500...600 п.о.. Illumina не сможет им ничего противопоставить и продолжит давить на любимую мозоль полупроводниковой технологии - плохое чтение гомогенных повторов.

http://image-sensors-world.blogspot.ru/201...ing-review.html

http://www.genomeweb.com/sequencing/roche-...encing-business

Спасибо за новость. Она была предсказуемой, но официальное заявление о кончине пиросеквенирования появилось только сейчас.

Жадность фрайера сгубила.

Но может быть это даже хорошо, что Рош "чистит" вредные и прожорливые новые технологии, убивая заодно и потенциальных конкурентов. Я в душе очень рад этому.

В Африке дети голодают, а они черт знает чем занимаются.

http://online.wsj.com/article/PR-CO-20131022-906487.html

из текста не понято - вместо "емулшн ПЦР" - "изотермал емулшн" ?

http://www.ad-hoc-news.de/ion-torrent-redu...e/News/32470565

На днях QIAGEN приобрёл CLC bio и собирается в 2014 году вывести на рынок свой флуоресцентный "карусельный" секвенатор GeneReaderТМ:
http://www.clcbio.com/blog/qiagen-acquired-clc-bio/

у киагена нет ни одной железяки которую они доделали до ума



у квакагена количество кретиНоидов превысило апплу

Они не занимаются "доделыванием железяки". Они платят деньги разработчикам, давно занимающимся этим прибором. Его первая версия (Polonator G.007) была вполне работоспособной. А были ещё вторая (Max-Gen):
http://www.azcobiotech.com/instruments/maxseq.php
и третья (Mini-20):
http://www.azcobiotech.com/instruments/mini20.php
Буду очень рад, если у Illumina появятся достойные конкуренты. Правда, химия у них попроще и длинных ридов ожидать не приходится, но флуоресцентное секвенирование может стать намного дешевле.

http://www.bloomberg.com/news/2013-10-23/o...-sequencer.html

надежда еще есть?

правда есть мнение, что это будет не полноценное секвенирование с соблюдением необходимой точности. а лишь инструмент для повседневного пользования, ну типа ориентацию вставки быстро протестировать, за 15 мин))

http://blog.nextgenetics.net/?e=93

На Oxford Nanopore я уже давно не надеюсь. У них даже руководство разбежалось, с которым держатели акций пытались судиться за сокрытие информации.

вот тут смотрим рисунок 3б в ултрадип футрингтинг метнодом ултрасиквинированием Хисек2000 болше 500 миллионов парноконцевых ридов - видят трансфак БЦЛ6 по мотиву - но в геноме человека ест второй трансфак с темже ДНК байндинг мотивом - БЦЛ6б зато публикуха в нейче

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3736582/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&C...ToSearch=255877

Кто новые машины видел уже?
Сколько кит на 400М пар стоить будет для новой машины среднего размера?

Стоимость кита не знаю. Пока есть только примерные данные о стоимости одного запуска Иллюминовского секвенатора (в США):
MiSeq - 1395$; NextSeq 500 - 3960$; HiSeq 2500 - 43000$.
Если на HiSeq 2500 запускать только одну дорожку из четырёх, то и в этом случае одиночный запуск будет самым дорогим (~11000$), а цена за милилард п.о. будет выше, чем у NextSeq 500.
Не позднее февраля Термофишеру (Ion Torrent) придётся сделать ответный ход. Скорее всего, они временно откажутся от больших геномных гонок и до появления принципиально новой модели нацелятся исключительно на экспрессное клиническое секвенирование.

Странные цены для запуска HiSeq'a.

У нас вообще реактивы на запуск ДВУХ дорожек с быстрыми настройками машины (RAPID MODE) стоит менее 2 тысяч баксов - то есть, 300-400М парных ридов (300-400М уникальных фрагментов) стоит меньше 1000 долларов на дорожку. Только реактивы выходят примерно 20 баксов у нас на миллиард букв для прогона 100-на-100.

Конечно, машина стоит под лям и контракт около 100 тысяч в год.

Новости AGBT 2014:
Oxford Nanopore представил первые данные о работе своего нанопорного секвенатора MinION. Длина ридов у него вполне приличная (~5 т.п.о.), но точность чтения очень низкая. О производительности ничего не сообщается.
http://flxlexblog.wordpress.com/2014/02/14...with-real-data/

Обзор новинок:
http://www.biocompare.com/Editorial-Articl...ng-2014-Update/

До недавних пор разработчики NGS имели обыкновение раз в году, в середине февраля, встречаться во Флориде на конференции AGBT (Advances in Genome Biology and Technology) и мериться длинами секвенирования и производительностью своих приборов. Там же делались сенсационные заявления об ожидаемых в ближайшем будущем новинках. В этом году традиция была нарушена.

Сначала компания Illumina, являющаяся лидером рынка NGS, постаралась опередить конкурентов и все свои сенсационные заявления - о новейшем секвенаторе NextSeq 500 и планах выпуска HiSeq X Ten - сделала 14 января на конференции JMP 2014. Ничем не порадовали на AGBT и их ближайшие конкуренты из Ion Torrent. Точнее - из Life Technologies, которой принадлежит Ion Torrent. Ещё точнее - из Thermo Fisher, которая накануне конференции завершила поглощение Life Technologies, которой принадлежит Ion Torrent.

При отсутствии серьёзных сенсаций вполне достойно выглядели скромные сообщения о достижениях разработчиков мономолекулярных технологий - Pacific Bioscience и Oxford Nanopore. Первые, несмотря на явную неконкурентоспособность свой флуоресцентной технологии, продолжили её совершенствование и даже смогли продать несколько секвенаторов. Вторые ежегодно обещают начать продажи миниатюрных секвенаторов, а в прошлом году даже запускали программу их предоставления ограниченному кругу заинтересованных лиц. В этом году программа доступа не изменилась, т.е. осталась в "подвешенном" состоянии. Тем не менее, были представлены первые данные, доказывающие работоспособность нанопорного секвенатора MinION. Данные довольно скромные, но свидетельствующие о том, что ставить крест на нанопорах ещё рано.

Главной сенсацией на AGBT стала информация компании GenapSys:

New complimentary webinar from Science:
The Sequencing Continuum for Clinical Research: From Sanger to Next Gen
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=541260

Кажется, началась новая эра геномного секвенирования. Несколько часов назад компания GenapSys начала составлять списки желающих поучаствовать в тестовых испытаниях принципиально нового полупроводникового секвенатора GENIUS 110™:
http://www.pr.com/press-release/543000


В технологии Ion Torrent полевые транзисторы чипов регистрируют быстрые изменения заряда на поверхности pH-сенсорных полевых транзисторов. Отличительной особенностью технологии GenapSys является регистрация изменения заряда ДНК при её синтезе на поверхности таких же полевых транзисторов. При таком подходе количество сенсорных пикселов может измеряться не миллионами (как у PGM и Ion Proton), а миллиардами:
http://biomics.ru/nomera/2013/56-sekveniro...nirovaniya.html
http://biomics.ru/nomera/2013/57-rothberg-...sequencing.html

Кто-нибудь будет заявку подавать?

А пробоподготовка у него какая?

Пишут, что на бидзах, но может быть и наноболльная.

Сегодня сфабриковал на эту тему заметку в колонку новостей :
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=541462#1469052

Спасибо Редактору! Он очень оперативно выложил её на главной странице сайта.

Некоторые подробности о NextSeq 500, HiSeq X и их конкурентах:
http://www.biomedcentral.com/biome/welcome...he-1000-genome/

Биологи под руководством известного генетика Джорджа Черча создали метод секвенирования РНК in situ, который позволяет составить карту экспрессии тысяч генов в масштабах от субклеточного уровня до целого мозга или эмбриона. Описание метода опубликовано в Science, кратко о нем можно посмотреть в ролике Nature News. http://www.sciencemag.org/content/early/20...science.1250212

Метод получил название FISSEQ (флюоресцентное секвенирование РНК in situ). Латинским выражением in situ биологи обозначают те методы, которые дают пространственную информацию, — данные которых привязаны к конкретной точке клетки или организма. В данном случае секвенирование FISSEQ позволяет определить последовательности молекул РНК, которые находятся в разных частях клетки. Секвенирование проходит с высоким, напоминающим оптическую микроскопию разрешением.

Процедура выглядит следующим образом. Сначала образец фиксируют и разрезают на тонкие слои. Затем из клеток удаляют мембраны, при этом РНК, ДНК и белки остаются фиксированы в матрице (этот метод «просветления» был изобретен недавно с целью получения прозрачного мозга). РНК с помощью обратной транскриптазы переводят в соответствующую ДНК-копию, которую затем многократно амплифицируют. В результате из одной молекулы РНК образуется кластер идентичных фиксированных молекул («наношарик»). В нем представлена не вся исходная РНК, а только ее фрагмент, но этого фрагмента достаточно для надежной идентификации всей молекулы. Затем используются уже известные методы пиросеквенирования: к образцу добавляют меченые основания, и во время синтеза новых копий ДНК в разных точках образца загораются разные сигналы.
http://lenta.ru/news/2014/02/28/fisseq/

Рош сообщили о поглощении Genia Technologies с целью совершенствования технологии полупроводникового нанопорового секвенирования.

Интересно: это просто захват рынка или все-таки доведут до практического использования в медицине, как это позиционировалось в виде портативного приборчика повседневного пользования? Ведь это уже не первая нанопоровая компания, которую они "едят", да и с IBM-овскими ДНК транзисторами давно всотрудничают...

Спасибо за новость:
Roche Acquires Genia Technologies for up to $350M
Published: Monday, June 02, 2014

Судя по стоимости сделки, работоспособность этой технологии у рошевцев уже не вызывает сомнений. У меня по поводу её работоспособности особых сомнений не было уже пару лет назад. Очень рад прогрессу Genia. Наверное, скоро и их конкуренты (Intel + PacBio) заявят о своих успехах.

Задам сюда вопрос, на вид очень простой, может кто-то с лёту знает ответ?

Пришли люди от профессора, которая разработала RNA-seq 6 лет назад и жалуются, что single-cell RNA-seq плох и основная проблема - очень сильно клетки различаются - короче, метод - никакой пока! Они нашли проблему у известного коммерческого кита - одна из реакций имеет всего 10% эффективности! Стоит к тому же 200 баксов за клетку - дорого(
Идея - сделать очень простой метод в плашках без оборудования по 200 тысяч баксов. Что радует - сделал 1 тест и вроде вся молекулярка у меня сработала с первого раза (но думал пол-года! Взял 3 пикограмма тотальной чистой РНКи и после 18 циклов ПЦР очень хороший выход мРНКа библиотеки. Так как буду смешивать много-много библиотек, то 14-15 циклов будет выше крыши.

Идея - не чистить клетки, а провести все реакции в 1 пробирке.

Вопрос в самом первом шаге протокола - как мягко и вежливо лизировать клетку?
Как лизировать 1 клетку в 2-3 мкл раствора (макс 4 мкл) с такими условиями:

1. Клетка должна отдать всю! РНКу (минимум 90%), включая ядерную РНКу и желательно не плавить сильно геномную ДНКу. Что-то в лизирующем растворе должно хорошо убирать мембраны, но детергентов много нельзя (см. #5).
2. Клетку можно и нужно греть (буду сразу фрагментировать РНКу).
3. Убить РНКазы и почти все белки клетки (нагрев сильно поможет), потом будут кинуты ингибиторы РНКаз, так как РНКаза выживет после прогрева.
4. Использовать мало соли, типа максимум 50 мкл хлорида лития.

5. После нагрева в лизирующем растворе РНКа из клетки БЕЗ очисток должна пережить 1 час в реакции обратной транскрипции или других ферментных реакциях со слабой солью. Лучше использовать такой раствор, в котором РНКа переживёт минут 15-20 кипячения, клетка полностью разрушится и РНКа развалится до кусков в 100-500 оснований.

Что точно нельзя:

А. RLT buffer (ГТЦ) не прокатит - чистить нельзя - он ферменты убьёт, то же и со всякими RNA storage solution, RNA later - там очень много соли, мочевину тоже нельзя.

Б. Нельзя много детергентов, типа SDS, лучше без них - фермент слабый.

Что можно, но в меру:

1. Немного хлорида лития/калия.
2. Немного ДМСО, ДТТ, ТРИСа. Очень немного Тритона или ЭДТА.

Что пробовал:
Грел клетки в воде, слабом Тритоне, слабом Трисе, ЭДТА, ДТТ, ДМСО, LiCl, цитрат натрия - результаты очень разные, выход РНКа различается раз в 10, стабильность РНКи тоже разная. Странно, но цитрат натрия убил РНКу в ноль.

Было бы время - намешал бы десятки разных буферов и всё проверил - но начальство не даёт добро на проект, хотя вся молекулярка прошла просто шикарно.

Гуанидин тиоцианат, финальная концентрация в RT ~40mM
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...1-2199-9-63.pdf

BSA и Trehalose творят чудеса, как ни странно, при лизисе клеток. В ссылке про BSA, его можно бухать в избытке:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3819639/
Вместо Na⁺ - K⁺, NH₄⁺

Огромное спасибо за BSA!

Думаю, он как раз не навредит в последующих реакциях.
Будет время - попробую его и есть ещё один очень простой кандидат.
Если взять нейтральные вещества, то клетку можно варить долго - РНКа нужна фрагментированная.

Мне кажется, проблема "одноклеточного" секвенирования РНК заключается не в тонкостях её выделения, а в особенностях синтеза. Известно, что он регулируется посредством включения/выключения в отдельных клетках, а не плавным изменением уровня транскрипции. Поэтому изучать экспрессию генов на отдельных клетках просто бессмысленно.
http://www.nature.com/nature/journal/v498/...NATURE-20130613

От них статьи не читаем - данные их моему начальству не нравятся, но вслух этого не говорят
И это не смотря на то, что у меня с их лабой статья в Селл вышла, так как сидели на одном этаже
Это лаба с самым больших бюджетом, который я слышал в жизни - там десятки лямов грина и около 100 человек в лабе, но выхлоп там небольшой на каждый лям Очень скромный

http://resource.lifetechnologies.com/pages...Seq%20Exome.pdf
________________
блиндирани врати, монтаж врати, решетки

[quote=AniGoch,17.06.2014 06:45]  http://resource.lifetechnologies.com/pages...Seq%20Exome.pdf

Новая технология,
вместо 454 теперь 404 )))

Термофишер купил Рош?

В развитии технологий геномного секвенирования наступила эпоха застоя . Новостей почти нет . Можно, правда, отметить китайцев (Novogene), которые недавно начали принимать заявки на секвенирование человеческих геномов (x30) по 1600$ на HiSeq X Ten :
http://www.novogene.cn/en/index.php?m=cont...&catid=33&id=19
Да ещё Термофишер в августе начал продажи комплектов для сцепленно-концевого (Mate-Pair) секвенирования, причём не своих, а Люцигеновских :
http://www.strategic-directions.com/_a/ind...1b-dac1bfb3a378
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A25614

А какие новости в развитии ПЦР ??? Просто рутиной стало...

Новостей о ПЦР не видел. Правда, особо за ними и не следил. Да и за NGS слежу всё реже и реже. Поэтому пропустил новость из Китая. Оказывается, им удалось "передрать" рошевский пиросеквенатор:
http://english.big.cas.cn/ic/ip/201209/t20120924_91378.html
Испытали его (BIGIS-4) ещё в 2011 году. Вывести на рынок (внутренний) хотят к концу этого года. Реагенты используют рошевские, но экономно, что может удешевить пиросеквенирование в 5 раз.
Теоретически такое удешевление позволит конкурировать с полупроводниковой технологией, но не долго. Они (китайцы) должны "передрать" и синтез всех расходных реагентов, поскольку рошевцы намерены прекратит их выпуск в 2016 году.
Так что китайцы могут в ближайшие годы обеспечить весь мир дешёвыми геномными пиросеквенаторами. Тем более, что патентная защита пиросеквенирования закончилась в 2007 году.

Ещё одна пропущенная мной новость.

MinIon, несмотря на моё неверие в его нанопорную технологию, похоже, работает:
http://www.genomeweb.com/sequencing/minion...ies-snp-calling
Если никогда не бывали на этом сайте, то сможете прочесть. Если потребуют подписку, то нужно закрыть страничку, удалить куки genomeweb.com и снова зайти. Если не получится, то усечённое и искажённое сообщение можно посмотреть в Компьютерре:
http://www.computerra.ru/106942/minion-por...e-dna-analyzer/

На всякий случай передрал текст исходного сообщения из Insequence:

Здравствуйте!
Подскажите пожалуйста, есть ли в России лаборатории, идентифицирующие ДНК простейших по одной-нескольким клеткам? Необходимо идентифицировать редкий некультивируемый организм, выделенный из образца в количестве всего нескольких клеток. Возможно ли секвенирование обычным методом Сенгера низкой концентрации ампликонов?
Заранее огромное спасибо! smile.gif

обратитесь к В.В. Алёшину из НИИ ФХБ, по редким некультивируемым протистам он спец

Спасибо большое! Да, мы о нём знаем, и кто-то даже знаком, хотели разобраться сами ))
попробуем сделать ампликоны с 1 клетки известного вида и проверим концентрацию чтобы представлять масштабы возможностей.

Делаете полногеномную амплификацю (WGA) и секвенируете любым способом.
Алешин разве ушел из Университета?