эх, сделал бы кто-нибудь хоть грубо набросок обзора для dummies с табличкой в каком-нибудь google sheets: модель, скорость, точность, длина ридов, цена за скороварку, цена за кит/чип, прибл цена за полное сиквенирование сэмпла, etc
и расшарить на редактирование с тем, кто в теме и кому доверяете -- вот было бы здорово, +1000 в карму!
dk, 30.03.2017 23:00
А вот у меня такой наивный вопрос - а этот МинИОН сможет заменить "классическое" секвенирование? Если использовать "баркодинг" на 96 образцов, то в 1 ячейке за 300 баксов - цена 1 образца будет около 190 рублей. Пусть пробоподготовка увеличит её ещё вдвое - выходит около 400 р. Это ещё выше себестоимости (при условии "бодяжения" бигдая и "левого" полимера), но уже сравнимо с услугами коммерческих компаний на "сэнгеровских" капиллярниках. Или я не правильно понимаю суть процесса?
Чота как-то дорого, не? Minion стоит тыщу (5 штук - 5 тыщ), а этот 125. Я конечно понимаю, что там хороший проц и память, но неужели все это железо стОит 120 тыщ?
LMP, 31.03.2017 11:02
(dk @ 30.03.2017 21:00)
А вот у меня такой наивный вопрос - а этот МинИОН сможет заменить "классическое" секвенирование?
С точностью у них не очень, тут где-то генсек испытания выкладывал. Соответственно и приложения у них больше скрининговые https://nanoporetech.com/applications Потом все равно, видимо, "пересеквенировать" по сэнгеру придется. Ну и не надо забывать, что ихнюю стоимость надо на "N" раз умножать, чтобы учесть наценки.
genseq, 31.03.2017 11:12
(vak @ 30.03.2017 19:45)
эх, сделал бы кто-нибудь хоть грубо набросок обзора для dummies с табличкой в каком-нибудь google sheets: модель, скорость, точность, длина ридов, цена за скороварку, цена за кит/чип, прибл цена за полное сиквенирование сэмпла, etc
и расшарить на редактирование с тем, кто в теме и кому доверяете -- вот было бы здорово, +1000 в карму!
С точностью у них не очень, тут где-то генсек испытания выкладывал. Соответственно и приложения у них больше скрининговые https://nanoporetech.com/applications Потом все равно, видимо, "пересеквенировать" по сэнгеру придется. Ну и не надо забывать, что ихнюю стоимость надо на "N" раз умножать, чтобы учесть наценки.
Над точностью им ещё работать и работать, тем не менее последние результаты обнадёживают. Если в прошлом году количество ошибок было запредельным (10...15%), то на новых порах (версия 9.4, с хеликазой) ошибок уже меньше 10%. Точнее - 5...6%, а это уже совсем неплохо. Но самое смешное то, что на этих порах несколько процентов ридов читаются дважды. Т.е. вторая нить, вытесняемая хеликазой, после окончания чтения первой нити влезает в ту же пору и чтение продолжается. В этом случае точность чтения повышается до Q20 или даже выше. Этот фокус теперь называется 1D2-секвенирование. На порах 9.4 количество таких двойных ридов составляет 3..4%, но в мае оксфордцы обещают перейти на поры версии 9.5, которые увеличат количество двойных ридов до 50...60%.
Генсек, спасибо! Выходит около 250 руб за прочтение вместе с пробоподготовкой (для ГридИОН). Очень даже привлекательно. Если они повысят качество до 99% (при повторных прочтениях) то есть вероятность замены "нанопорами" секвенаторов для "малых групп" через пару лет.
minION порвал мой моск! отрезвили лишь цены использования. но всё же как круто... ещё несколько лет и будет очено забавно всё.
NMR-guy, 03.04.2017 15:45
Только если это всё правда. Давайте подождем статей и каких-то публично-доступных массивов сырых данных и прог их просмотра с этих секвенаторов, дабы можно было скачать и самим оценить что из этих пор вылазит.
genseq, 05.04.2017 09:12
(NMR-guy @ 03.04.2017 13:45)
Только если это всё правда. Давайте подождем статей и каких-то публично-доступных массивов сырых данных и прог их просмотра с этих секвенаторов, дабы можно было скачать и самим оценить что из этих пор вылазит.
Пока не вложу персты в сырые данные от "британских учоных" и не проверю случайную выборку из десятка-другого ридов из них против рефсика в Бласте - не поверю. Всё вышенарисованное может быть рекламными мультиками для "владельцев айфонов".
Вся соль этих безамплификационных технологий - в снижении частот ошибок детектора на поре. Пока нет никаких данных, как работают сами поры и софт, который обрабатывает сырой сигнал с них.
И еще: если в софт миниИОНа встроен рефсик на самые распространенные организмы и он не "читает" буквы, а "восстанавливает" их в основном по соответствию рида и рефсика, опираясь на крайне зашумленный сигнал с поры - то это жульничество обязательно вскроется при секвенированиях де-ново, всякими экологами, когда их попытки засунуть туда ДНК из литра почвы (к примеру) не выдаст им ничего нового, что уже не содержится в рефсике (локальном).
Пока не вложу персты в сырые данные от "британских учоных" и не проверю случайную выборку из десятка-другого ридов из них против рефсика в Бласте - не поверю. Всё вышенарисованное может быть рекламными мультиками для "владельцев айфонов".
Вся соль этих безамплификационных технологий - в снижении частот ошибок детектора на поре. Пока нет никаких данных, как работают сами поры и софт, который обрабатывает сырой сигнал с них.
И еще: если в софт миниИОНа встроен рефсик на самые распространенные организмы и он не "читает" буквы, а "восстанавливает" их в основном по соответствию рида и рефсика, опираясь на крайне зашумленный сигнал с поры - то это жульничество обязательно вскроется при секвенированиях де-ново, всякими экологами, когда их попытки засунуть туда ДНК из литра почвы (к примеру) не выдаст им ничего нового, что уже не содержится в рефсике (локальном).
Да, спасибо, именно на САМЫЕ сырые, прямо которые прибор этот генерит в виде ридов, в формате fastaq.
И хотелось бы побольше разнообразия в тех организмах, которые секвенируются, а еще лучше - какое-нибудь повальное генотипирование или толпы добровольцев или выборки каких-нибудь организмов. Чтобы были видны В СЫРЫХ ДАННЫХ снипы, которые можно бы было соотнести с измеренными частотами в исследованной географической популяции, и проверить на хардивайнберга.
genseq, 08.04.2017 16:44
Все вопросы - сюда :
Картинки:
ONT_MDx.JPG — (77.9)
Guest, 09.04.2017 13:58
Это - заинтересованное лицо-"британский ученый", и правды с него не взять.
Нужны реальные юзеры, причем вне их "программы доверия" и "доступа к нанопоре". Эти реальные юзеры выкладывают данные на всеобщую скачку, если в текстовом неархивном формате FASTAQ - вообще бы было идеально.
Несколько десятков датасетов с разных людей (к примеру) - и все лично мне станет понятно.
Интересно, а у нас хоть одно ведомство в стране способно в принудительном порядке заставить полногеномно генотипироваться хотя бы 1 млн россиян? ЕСЛИ про пору - правда, то можно даже представить на чём уже. Не ждать же окончания британского патента 20 лет?
criplenie, 12.04.2017 19:57
(Olga Kn. @ 07.03.2017 13:41)
Уважаемые коллеги, есть ли на форуме активные пользователи Ion torrent? Наш институт получил сей девайс два года назад и все боятся к нему подходить. Прибор уже три лабы сменил и так и не начал свою трудовую деятельность) киты стартовые стоят не распакованные. Можно ли их использовать хотя бы для тренировки и получить хоть какие-то результаты? Срок истек год назад.
Чипы - явно можно. Химия - как повезет, зависит от условий хранения. Киты для приготовления библиотек живые с вероятностью 95%, но может быть некомплект. А вообще сперва, надо сформулировать задачу, а не секвенировать абы что. В идеале - покупать оборудование под задачу , но это фантастика. Ну и расположение знать полезно. В Москве желающие посеквенировать найдутся легко, возможно даже со своими китами.
genseq, 14.04.2017 16:35
Решил как-то отметить День ДНК (25 апреля).
Картинки:
NGS___2017.JPG — (11.71)
NMR-guy, 17.04.2017 21:29
Вы там времени не теряйте - белки у них указаны, соображайте что они в них заинжинирили и вперед - в повторение разработки для своих. Детектор, как я понимаю, там вполне обычный, раз они его в USB-палочку засунули. Замедляете протаскивание через пору до нужной скорости - и вперед к выделению и рефолдингу этих клонированных и заинжениренных пор.
genseq, 19.04.2017 09:33
(NMR-guy @ 17.04.2017 19:29)
Вы там времени не теряйте - белки у них указаны, соображайте что они в них заинжинирили и вперед - в повторение разработки для своих. Детектор, как я понимаю, там вполне обычный, раз они его в USB-палочку засунули. Замедляете протаскивание через пору до нужной скорости - и вперед к выделению и рефолдингу этих клонированных и заинжениренных пор.
Белки там очень хитрые. Например, нанопорой служит модифицированный CsgG, а хеликазой - Rep-X (т.е. Rep, у которого две аминокислоты заменены цистеинами и соединены синтетическим линкером): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4417355/ Да и электроника не стандартная. Общие описания возможных вариантов есть здесь: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27509529 А конкретные описания отсутствуют. Известно только, что массив из 2048 ячеек для нанопор, каждая из которых имеет свой каскадный операционный усилитель, подключается через FPGA к 512 АЦП, причём все сигналы с их цифровых выходов пакуются и передаются на компьютер через USB 3.0.
sceptique, 19.04.2017 10:19
Какие они хитрые - они бактериальные и вирусно-бактериофажные, судя по названиям. То есть - идеально клонируются и экспрессятся. А если они хорошо клонируются и экспрессятся - уже давно можно было посадить пяток-другой дипломников на ковровый аланиновый мутагенез всего того, что в нем отличается от аланина с оценкой функциональной активности какой-нибудь относительно простой (полупроницаемые мембраны с добавлением ДНК с одной стороны и измерением скорости появления ДНК с другой, детекция - проточные микрокюветы из кварца с измерением поглощения на 260нм) методикой. Судя по тому, что в соавторах второй статьи много китайцев - именно этим путем они и шли. Путь простой, биообъект уже указан, с которым все получилось. Соврать в этом нельзя - патент не получишь. В чем проблема?
Собственно, по графику тока понятно, что если этот мрак и ужас (а готовый предусилитель и АЦП для одномолекулярного детектора можно взять из статей по одноканальному патч-клямпу в электрофизиологии) удастся замедлить и откалибровать по типу сигнала от одного из 4 видов нуклеотидов - собственно проблема решена. ДНК-полимераза там явно используется тоже для калиброванного замедления синтеза. А пора - для гарантированного "непротекания" мембраны никаким другим образом кроме просачивания ДНК. Вы сделайте это для одного канала под микроэлектродом патч-клямпа и его усилительной электроникой. Размножить получившееся в 1 точке на 1 канале на массив CMOS - это проще, когда знаешь как должен выглядеть идеал.
Или Вы считаете, что китайцы нам все сами расскажут и принесут? Они скорее к себе в Китай, где нет патентного права, это продадут, из благодарности товарищу Мао за счастливое детство.
UPD: читаю статью про хеликазу Реп-Х - там же даже указано что менять на цистеин, указано, что важно подобрать правильную длину кросслинка с малеимидом (то есть - все остальные цистеины нужно менять на аланины и подобрать условия сшивания-очистки). Навреняка от длины этого полилинкера и зависит процессивность олигомера по расшивке ДНК.
UPD2: повторять экзерсисы авторов с ФРЕТом и оптическими "пинцетами" с одной единственной геликазой совершенно незачем - на этот бред уйдут годы. Хотя опыт по разобщению 18-нуклеотидного двухцепочечного "зонда" с разгоранием флуоресценции неплох в качестве средства измерения, жаль только ассоциироваться обратно этим зондам ничто мешать не будет (а при повышенной температуре, мешающей обратному отжигу, хеликаза может работать не так, как при комнатной).
Какие они хитрые - они бактериальные и вирусно-бактериофажные, судя по названиям.
Интересно, почему они тогда не воспользовались репликацией по механизму катящегося кольца? Сделать кольцо на 10-40 кб и пусть читается десять раз подряд. Расплетение цепи и постоянная скорость продвижения без принятия дополнительных мер. Для лучшего распознавания можно подсовывать модифицированные dNTP. Не верю что они так просто проморгали такое очевидное решение. Метилирование прочесть не получится, но там высокая точность чтения и не нужна.
genseq, 25.04.2017 09:10
(criplenie @ 24.04.2017 11:20)
Интересно, почему они тогда не воспользовались репликацией по механизму катящегося кольца? Сделать кольцо на 10-40 кб и пусть читается десять раз подряд. Расплетение цепи и постоянная скорость продвижения без принятия дополнительных мер. Для лучшего распознавания можно подсовывать модифицированные dNTP. Не верю что они так просто проморгали такое очевидное решение. Метилирование прочесть не получится, но там высокая точность чтения и не нужна.
Идея очень верная. Наверное, ей скоро воспользуются. Как и ДНК-наноболлами, с которыми можно использовать хеликазу. Хороших идей много, а вот людей на всё не хватает. Но уже скоро и у Вас появится возможность поэкспериментировать с нанопорами и с такими идеями. Главное - чтобы не пропало желание. А если его и не было, то чтобы появилось.
-Ъ-, 25.04.2017 11:40
(genseq @ 25.04.2017 10:10)
Идея очень верная. Наверное, ей скоро воспользуются. Как и ДНК-наноболлами, с которыми можно использовать хеликазу. Хороших идей много, а вот людей на всё не хватает. Но уже скоро и у Вас появится возможность поэкспериментировать с нанопорами и с такими идеями. Главное - чтобы не пропало желание. А если его и не было, то чтобы появилось.
Катящееся кольцо залипнет на первом же ГЦ-богатом участке в геноме, 80-90%GC и кольцо дальше не покатится. CpG станут тоже непроходимыми, а это всё сразу похоронит применение технологии в широкой практике для секвенирования.
А идея китайцев в Чикаго с измененной под задачей хеликазой хороша тем, что длиной S-S кросслинка они могут относительно плавно регулировать процессивность, и если оно будет расплетать с нужной скоростью всё от 10-20%GС до 80-90%GC - это уже технология, а не маниловщина и не развод государства на последние бабки в пользу своей родни.
criplenie, 25.04.2017 15:28
phi29 вроде имеет очень хорошую процессивность и для ГЦ-богатых участков.
genseq, 02.05.2017 16:35
Фондом поддержки МП в НТС объявлен конкурс "Медицина 2017", включающий лот 2 - «Разработка системы одномолекулярного массивного оптического параллельного анализа последовательностей нуклеиновых кислот». Приём заявок до 18 мая. http://fasie.ru/press/fund/fond-sodeystviy...ykh-proektov-v/ Интересно, кто это подсуетился? Если новосибирцы, то "осваиваемая" ими технология к этому году уже устарела.
Главное - поМАССИВНЕЕ и ОПТИЧЕСКИ ПОПАРАЛЛЕЛЬНЕЕ. И отползать потом за срок давности...
genseq, 02.05.2017 19:06
(NMR-guy @ 02.05.2017 15:58)
"Осваиваемая" ими технология не устареет никогда.
Главное - поМАССИВНЕЕ и ОПТИЧЕСКИ ПОПАРАЛЛЕЛЬНЕЕ. И отползать потом за срок давности...
Похоже, новосибирцы тут ни при чём. Это больше похоже на Зеленоград. Там собирались реанимировать технологию Helicos, и в 2014 году даже приобрели Heliscope, который весит около тонны (стоит больше миллиона баксов), причём по-дешёвке - всего за 50 млн. рублей.
sceptique, 03.05.2017 21:09
А они в заявке не запросили миллиард рублей на вывод этой своей "тонны" в космос для отработки лучших условий секвенирования и решения задач миниатюризации? Британские ученые миниИОН в космос уже забрасывали, а этим почему ЕЩЁ 1 млрд не дать распилить? Космос же!
genseq, 07.05.2017 18:53
4...5 мая в Лондоне прошла первая конференция, целиком посвящённая технологии секвенирования и секвенаторам Oxford Nanopore: https://www.genomeweb.com/sequencing/oxford...on-user-meeting Кое-что уже просачивалось в Интернет, но были и новые заявления. 1. Продажи GridION X5 начнутся 15 мая. 2. С 8 мая начнётся рассылка ячеек с порами 9.5 (для двукратного чтения типа 1D2). 3. Разрабатываются удешевлённые ячейки Flongle (128 или 256 каналов вместо 512) для MinION (с адапторной вставкой). 4. PromethION появится в продаже только в 2018 году, причём под новым именем - "MKI".
Картинки:
MKI.jpg — (45.6)
Sergeant, 16.05.2017 10:32
Всем привет. Если быть строгим то у меня вопрос не совсем по теме. Просто не хочу плодить лишнюю ветку по NGS. Я пытаюсь разобраться как работает псевдоэлайнер Каллисто. И у меня возникает много вопросов по алгоритму его работы. Как я понимаю, все начинается с постройки "индекса" на основе транскиптома модельного организма. Этот как бы индекс фактически граф Де Брейна для транскриптома. Поиск рида в транскиптоме сводится к разбивке каждого рида на к-меры и поиске пути в графе Брейеа для этих к-меров. Развилки в графе представляют собой различные изоформы гена. После того как все риды попытаются с переменным успехом отмапить на транскриптом можно посчитать сколько ридов приходится на каждый транскрипт. А вот далее мне совсем не понятно. К чему применяется бутстрэп? Как имея даже ОДИН образец Каллисто в паре с R строит для каждого транскрипта график "ящик с усами"? Мистика.
avial, 16.05.2017 22:39
(genseq @ 02.05.2017 14:35)
Приём заявок до 18 мая. Интересно, кто это подсуетился? Если новосибирцы, то "осваиваемая" ими технология к этому году уже устарела.
А там 90% заявок - чистый цирк со стороны институтов, якобы формирующих тематики. А может и 100%. Меня другое интересует - бортник несколько тщательнее относится к конечному результату гранта, отчетом там не отделаешься, чем собираются отчитываться фирмы, которые предложат вон те мутации на химиотерапию?
genseq, 18.05.2017 21:32
Сегодня на NGS-2017 Химэксперт рекламировал наборы для получения NGS-библиотек и баркодирования с торговой маркой GenSeqTM. Разработчики - компания ANPRO. Кто бы это мог быть?
Кажется, нет. У этих основной девиз - "Сделано в России". Хотя не исключено, что с той же торговой маркой эти наборы продаются и "за бугром".
Sergeant, 22.05.2017 10:54
Годная книжка и не очень заумно написана Wing-Kin Sung ALGORITHMS FOR NEXT-GENERATION SEQUENCING (Chapman & Hall/CRC Mathematical and Computational Biology)
Предлагал я тебе давно-давно зарегистрировать себя как Торговую марку... Кстати, у меня тоже есть задумка выпускать линейку китов под этой маркой, если канешна ты не против
Предлагал я тебе давно-давно зарегистрировать себя как Торговую марку... Кстати, у меня тоже есть задумка выпускать линейку китов под этой маркой, если канешна ты не против
GenPaq®, GenSeq, GenEx....
Конечно, я не против использования названия GenSeq. Тем более, что давно уже приобрёл домен www.genseq.ru . Сайт пока не работает, но этим летом постараюсь его запустить. Заодно залью туда информацию о всех наборах с маркой GenSeq. И пусть меня попробуют обвинить в использовании чужой торговой марки.
Васильевна, 07.06.2017 12:59
(LMP @ 31.03.2017 11:02)
С точностью у них не очень, тут где-то генсек испытания выкладывал. Соответственно и приложения у них больше скрининговые https://nanoporetech.com/applications Потом все равно, видимо, "пересеквенировать" по сэнгеру придется. Ну и не надо забывать, что ихнюю стоимость надо на "N" раз умножать, чтобы учесть наценки.
Вопрос про наценки для РФ. Помогите, люди добрые. Запросили цены на minIon Basic и киты. Цена для нас("конечника") на MinION в 8 (!восемь) раз превышает цену на сайте. На наборы типа "по-божески" - всего в 2-3 раза. Поставщика сдавать не буду, но интересно за счет чего может быть 8-кратная наценка? Может всего лишь кто-то ошибся?
-Ъ-, 07.06.2017 14:15
(Васильевна @ 07.06.2017 13:59)
Поставщика сдавать не буду, но интересно за счет чего может быть 8-кратная наценка? Может всего лишь кто-то ошибся?
Ну и гуляйте дальше лесом, партизан Васильевна! У нас тут на молбиоле посторонних нет, выкладывайте все начистоту.
sceptique, 07.06.2017 23:51
Все это - глупо и печально. Когда все друг другу врут и друг друга монетизируют.
А могли бы просто тупо взять и разработать всё это на своем белковом инжиниринге.
Но откаты так через оффшоры не заработать, конечно....
Васильевна, 08.06.2017 10:38
(-Ъ- @ 07.06.2017 14:15)
Ну и гуляйте дальше лесом, партизан Васильевна! У нас тут на молбиоле посторонних нет, выкладывайте все начистоту.
Гуляла по сайту госзакупок, та еще темная чаща. Больше не хочу, поэтому и пришла к вам. Подскажите, пожалуйста, нежадного поставщика. Мы же еще не купили MinION, только планируем.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.