Полная версия страницы  English  

ИФА

Pages: 1, 2
Gizelle, 11.02.2013 11:45
Друзья, помогите! Ставлю ИФА твердофазную: сорбирую на плашку антиген, забиваю молоком, вношу сыворотку (развожу в молоке). Титрую с определенным шагом. после - инкубация, отмывка, внесение конъюгата (тоже развожу в молоке) и снова отмывка. после тмб выдерживаю в темноте, короче, по протоколу. Вношу стоп - и тут начинается ужас. лунки, в которых разведение сыворотки было больше - выдают гораздо большие значения ОП, чем самая первая лунка с меньшим разведением сыворотки, хотя должно быть ровно наоборот. в итоге кривая получается не S-образная, а "горкой". уже не знаю, на что грешить. титрую аккуратно. Помогите!
guest: ммм , 11.02.2013 18:44
1) Лунки, которые с высоким разведением и большим сигналом находятся с краю планшета? Если да, то попробуйте их расположить так, что бы они были где-нибудь в середине.

2)А что с сигналом в контрольных лунках, в которых не был антигена, а было только молоко.

Если у вас горбик, то как я понимаю при дальнейшем разведении сигнал все же падает.

Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата.
vb, 11.02.2013 19:19
а зачем все в молоке разводить? я помню фосфатным и карбонатным буфером обходились с добавлением твина. это че сейчас так модно что ли ?
vtosha, 11.02.2013 23:37
Вот да, молоком вроде при вестерн-блотах забивают... Хотя, может, я чего не знаю.
berm, 12.02.2013 00:00
"Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата." - истинная правда smile.gif

несколько раз натыкался на подобную ситуацию и борол именно так, разбавлением сыворотки,разбавлением конъюгата, ну еше помог переход с твина на БСА smile.gif
Azato2000, 12.02.2013 12:12
1. У вас молоко - это разведенный обезжиренный молочный порошок или реально молоко?
2. А можно протокол посмотреть?
Azato2000, 12.02.2013 13:15
(Gizelle @ 11.02.2013 14:45)
Ссылка на исходное сообщение  Друзья, помогите! Ставлю ИФА твердофазную: сорбирую на плашку антиген, забиваю молоком, вношу сыворотку (развожу в молоке).


а вы отмывку перед внесением сывороток делаете?
Gizelle, 12.02.2013 13:19
Спасибо! Лунки с наименьшим разведением сывороток действительно находятся на краю планшета. Попробую переставить их в середину - спасибо, это для меня находка!) Что касается сигнала в лунках "пустых", то бишь содержащих только молоко, он слабый, сопоставим с сигналом явно отрицательных сывороток. Планшет забиваю раствором сухого обезжиренного молока, разумеется)) - в TBS или PBS, смотря чего не жалко). С разведением сывороток и конъюгатов я уже отшаманила до этого, когда после добавления стоп-реагента на донышках лунок выпадал черный осадок. Разведение конъюгата реально помогло в этом случае. Однако и с разведенным конъюгатом "горка" осталась.
Gizelle, 12.02.2013 13:26
(Azato2000 @ 12.02.2013 14:15)
Ссылка на исходное сообщение  а вы отмывку перед внесением сывороток делаете?


Да, разумеется. В двух словах: вношу раствор антигена в PBS в лунки, инкубирую при +4 ночь. Утром сливаю, и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20, после этого вношу сыворотки, разведенные в 5% молоке, титрую - и на 2 часа при +37. после отмывка, затем вношу конъюгат в молоке опять же, после отмывка, далее ТМБ+субстр. буфер и все, стоп.
Gizelle, 12.02.2013 13:28
(berm @ 12.02.2013 01:00)
Ссылка на исходное сообщение  "Возможно из-за ингибирования продуктом пероксидазной реакции в высоких концентрациях сигнал не накапливается. Возможно что может помочь разбавление коньюгата или уменьшение концентрации субстрата." - истинная правда smile.gif

несколько раз натыкался на подобную ситуацию и борол именно так, разбавлением сыворотки,разбавлением конъюгата, ну еше помог переход с твина на БСА smile.gif



Спасибо
Azato2000, 12.02.2013 13:48
черный осадок это мусор, а сколько раз отмываете и чем (в смысле вручную или на вошере)?

я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.
Guest, 12.02.2013 14:26
(Azato2000 @ 12.02.2013 13:48)
Ссылка на исходное сообщение  черный осадок это мусор, а сколько раз отмываете и чем (в смысле вручную или на вошере)?

я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

Титрую сразу в планшете таким образом: вношу во все лунки 50 мкл 5%молока в TBS-Tween, затем в первую - 25 мкл сыворотки, и титрую шагом 3: отбираю 25 мкл и и вношу в следующую, перемешиваю пипетированием и снова отбираю 25 мкл в следующую и так далее. и плюс 1 ряд лунок просто с молоком. Отмывку делаю вручную многоканальной пипеткой.
Про мусор : откуда он берется? я так понимаю, что это ТМБ выпадает в осадок (мелкие черные точки на дне лунок, особенно они наблюдаются в тех из них, где концентрация сыворотки наибольшая)?
Gizelle, 12.02.2013 14:29
Да, и отмываю каждую лунку по 4 разаx200 ul TBS-Tween20
guest: ммм , 12.02.2013 14:31
-я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

А вы так делаете???!!!! smile.gif

-- и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20.

Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше.
Azato2000, 12.02.2013 14:58
(guest: ммм @ 12.02.2013 17:31)
Ссылка на исходное сообщение  -я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

А вы так делаете???!!!! smile.gif


нет мы титруем в отдельной U-well плашке
просто из описания Gizelle они это делают непосредственно в ИФА плашке
поэтому мне стало любопытно КАК они это делают?
Gizelle, 12.02.2013 15:09
(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31)
Ссылка на исходное сообщение  -я так понял вы титровку непосредственно в тестовой планшете делаете, а как это технически делается?
допустим во все лунки внесли по 50 мкл дилюента.
потом в лунку А - 50 мкл образца,
перемешали
взяли 50 мкл и перенсли в лунку В
и т.д.

А вы так делаете???!!!! smile.gif

-- и вношу 5% обезжир. молоко (в PBS) - и на час при +37. после все лунки промываю TBS-Tween20.

Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше.

Делаю всё так, только тирую шагом 3. т.е. получается 1:3, 1:9, 1:27 и т.д. ...
Gizelle, 12.02.2013 15:12
(Azato2000 @ 12.02.2013 15:58)
 нет мы титруем в отдельной U-well плашке


а потом просто переносите на рабочую плашку?
Azato2000, 12.02.2013 15:13
(Gizelle @ 12.02.2013 18:12)
Ссылка на исходное сообщение  а потом просто переносите на рабочую плашку?


именно
Gizelle, 12.02.2013 15:14
(guest: ммм @ 12.02.2013 15:31)
Ссылка на исходное сообщение  

Промывку после забивки можно не делать. Может это даже лучше.

Сейчас прочитала в одной статье, что после забивки молоком промывают PBS, без твина
Gizelle, 12.02.2013 15:14
(Azato2000 @ 12.02.2013 16:13)
Ссылка на исходное сообщение  именно

а в чем вы сыворотки разводите?
Azato2000, 12.02.2013 16:00
(Gizelle @ 12.02.2013 18:14)
Ссылка на исходное сообщение  а в чем вы сыворотки разводите?


Сыворотки и антигены разводим буфером А: PBS 0,01 моль/л, pH 7,4 ± 0,20 с добавлением 0,05% (объем/объем)Tween 20

Если добавить 5% сухого молока получается буфер Б. Его не храним. Каждый день свежий. У вас также?
Azato2000, 12.02.2013 16:01
Мы промываем по 5 раз на вошере после каждой инкубации (кроме последней конечно)
guest: ммм , 12.02.2013 16:14
Нельзя разводить сыворотку в cенсибилизированнам планшете.
Azato2000, 12.02.2013 16:22
(guest: ммм @ 12.02.2013 19:14)
Ссылка на исходное сообщение  Нельзя разводить сыворотку в сенсебилизированном планшете.


добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается

только полипропиленовых
guest: ммм , 12.02.2013 16:48
ПП вас от неспецифической сорбции не спасет. smile.gif
Azato2000, 12.02.2013 16:54
(guest: ммм @ 12.02.2013 19:48)
Ссылка на исходное сообщение  ПП вас от неспецифической сорбции не спасет. smile.gif


да ладно, а допустим пробирки для разведения из чего делаются?
методике уже сто лет в обед и чего-то полипропиленовые плашки никто не меняет
guest: ммм , 12.02.2013 17:02
Вы на эту проблему не с той стороны смотрите. smile.gif
Azato2000, 12.02.2013 17:05
(guest: ммм @ 12.02.2013 20:02)
Ссылка на исходное сообщение  Вы на эту проблему не с той стороны смотрите. smile.gif


поясните пожалуйста
Gizelle, 12.02.2013 17:15
(Azato2000 @ 12.02.2013 17:00)
Ссылка на исходное сообщение  
Если добавить 5% сухого молока получается буфер Б. Его не храним. Каждый день свежий. У вас также?

Всё так же=)
guest: ммм , 12.02.2013 17:18
--добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается.

Сорбция на ПС на самом деле не сильно отличается от сорбции на ПП, я даже думаю что на ПС сорбируется чуть хуже. Если вы хотите реально уменьшить сорбцию пластика обработайте его сывороточным альбумином или желатином.
Azato2000, 12.02.2013 17:48
(guest: ммм @ 12.02.2013 20:18)
Ссылка на исходное сообщение  --добавлю, что разведение и в несенсибилизированных полистироловых плашках не делается.

Сорбция на ПС на самом деле не сильно отличается от сорбции на ПП, я даже думаю что на ПС сорбируется чуть хуже. Если вы хотите реально уменьшить сорбцию пластика обработайте его сывороточным альбумином или желатином.


в первый раз слышу
guest: ммм , 12.02.2013 18:18
Все бывает в первый раз. smile.gif
птаха, 12.02.2013 18:37
напишите
пжлст

какие ОП у Вас на разных разведениях первых АТ
может надо не с шагом 3 до 27 разводить
а с шагом 10 до 10000?
Gizelle, 12.02.2013 18:42
(птаха @ 12.02.2013 19:37)
Ссылка на исходное сообщение  напишите
пжлст

какие ОП у Вас на разных разведениях первых АТ
может надо не с шагом 3 до 27 разводить
а с шагом 10 до 10000?

разведения делала в последний раз от 1:9 шагом 3 вплоть до 1:6561. значения ОП= 0.7 (при 1:9) и далее примерно 1.3 (1:27), 1.01 (1:81) и далее плавно по убывающей
Gizelle, 12.02.2013 18:45
при 1:2187 ОП=0.2 ПРИМЕРНО, в пустой лунке с молоком порядка 0.050
птаха, 12.02.2013 18:54
нормальные у Вас результаты
не гневите бога
Gizelle, 12.02.2013 19:08
(птаха @ 12.02.2013 19:54)
Ссылка на исходное сообщение  нормальные у Вас результаты
не гневите бога

да, но... почему пр 1:27 значение ОП почти вдвое выше, чем при 1:9? возможно, дело действительно в расположении образцов на плашке. завтра узнаю)) Спасибо вам всем за помощь! cool.gif
птаха, 13.02.2013 04:22
не думаю,
что краевой эффект приводил бы к таким "катастрофическим" последствиям.
в любом случае, если будете менять расположение образцов, в качестве контроля обязательно используете прежнее расположение. и очень любопытно было узнать о результатах

мой Вам совет -
поменьше заморачиваясь и титруйте, начиная с 1/100
и
пусть прибудет с вами сила
Gizelle, 14.02.2013 14:58
Как выяснилось, расположение сывороток на краю планшета тут ни при чем. разница есть, конечно, но совершенно незначительная (сотые доли буквально) и вызвана, скорее всего, иными факторами. Также и предварительная раститровка в ПП плашке до нанесения на основную сильно на результат не влияет - тоже порядка сотых долей ОП, мне для качественного анализа в принципе это не важно, хотя было очень любопытно. Варьировала с титрами, начиная с 1:5 шагом 5 и с 1:10 шагом 10. загиб все равно не исчез. завтра буду пробовать то же, но с изменением концентраций конъюгата.
Gizelle, 14.02.2013 15:00
Видимо, действительно ингибируется моя пероксидаза продуктом. посмотрим
Azato2000, 14.02.2013 16:18
Продукты пероксидазы вода и кислород
Кислород окисляет ТМБ
Накопление продукта пероксидазы в сильно разведенных образцах?
У вас что конкурентный ИФА?
guest: ммм , 14.02.2013 20:12
-Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.

Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в сильно разведенных ингибирование меньше и сигнал больше.
Gizelle, 15.02.2013 10:49
(Azato2000 @ 14.02.2013 17:18)
Ссылка на исходное сообщение  
У вас что конкурентный ИФА?

Неконкурентый
Gizelle, 15.02.2013 10:53
(guest: ммм @ 14.02.2013 21:12)
Ссылка на исходное сообщение  -Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.

Хм! В слабо разведенных накопления продуктов ингибирующих фермент. А в слабо разведенных ингибирование меньше и сигнал больше.

Вы имели в виду, что в сильно разведенных ингибирование меньше, правильно я поняла?
guest: ммм , 15.02.2013 12:16
Ага!"
Azato2000, 15.02.2013 15:42
(guest: ммм @ 14.02.2013 23:12)
Ссылка на исходное сообщение  -Продукты пероксидазы вода и кислород

ЭЭЭЭ! Это не так.



честно говоря я не понял.
вода и кислород не являются продуктами пероксидазы?
guest: ммм , 15.02.2013 17:33
--вода и кислород не являются продуктами пероксидазы?
Ага! Это у каталазы так. А пероксидаза без восстановителя никакой кислород не выделяет.
Gizelle, 28.02.2013 10:58
А как вы думаете, насколько правомерно, так сказать, предварительно разводить сыворотки, например, в 10 раз и дальше все делать по обычному сценарию, а в конце при расчетах использовать некий коэффициент (те же 10) для получения истинных значений? я в вектор-бесте вроде встречала подобный вариант, а кто-нибудь в лабе делал это? подскажите, пожалуйста...
Panaev, 01.03.2013 04:45
Никто не может вам этого запретить smile.gif.
guest: Alex76 , 07.03.2013 07:38
У меня была похожая ситуация. Попробуйте больше развести антиген на плашке. Для блокировки планшета попробуйте взять БСА фракция 5 0,5-1% в ФБС с твином и сыворотки разводите на этом же растворе. И играйтесь с разведением антигена
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.