Народ, собираюсь выделить ядра, зафиксировать и покрасить на трансфак для последующего факса и возможно сортинга.

В принципе с cyto- и nuclear extract proteins опыт работы немаленький, но для моей настоящей задачи хочу обсудить некоторые тонкости.

1. Надо выделить по возможности чище и нативнее перед фиксацией.
Обычно для выделения использую гипотонический буфер: 10mM HEPES, pH-7.5; 10mM KCl; 10mM MgCl2; 1mM DTT; protese inhibitors. 15 мин во льду, добавляю NP-40 (до 1%), вортекс, Ц/ф 15-20 сек на 12000rpm, осадок промываю буфером без NP40 (можно пару раз), выделяю потом Nucltar proteins.
Вопрос: Что на этой стадии можно сделать нежнее? ц/ф?
Кстати, на подскажете градиент/плотность сахарозы, чтобы от остальной клеточной чачи избавиться?

2. Фиксировать буду как обычно, 4% параформальдегид/1хPBS этак мин 15 на льду.

3. Чем лучше дырявить ядра?

4. Чем лучше забивать? Goat serum? BSA? FBS? обычно пользовал 5% Goat serum для IF (Впрочем это уже другая тема)

5. Есть ли какие тонкости, чтобы ядра меньше слипались?

Заранее спасибо.

1. Если кратко, то сахароза и ультра центрифуга.

3. Вот с дырявленьем и вообще с прохождением АТ внутри ядра большие сомнения.

4. Это уже фигня ту с предыдущими проблемами бы справится.

5. Тонкостей нет, есть тупости. Типа разбавить.

по нежнее? ну при выделении цитозоля в пункте 1. я по протоколу гонял клетки через 27G иглу, а не вортекс

Мы использовали когда-то метод Метью 330 мМ сахароза, 0,2% Triton X100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-НСІ, рН 7,6. Неспешно "перетирали" клеточный осадок (получали осаждением после быстрого гемолиза, в оригинале буфер добавляют прямо к крови в 6м объеме если память не подводит) в стеклянном Поттере на льду, крутили на 4,500g 20 мин. Если надо промывали -перетирали еще раз-два. Агрегации обычно не было

Но если надо почище, то естественно нужно продавить на градиенте, пусть даже ступенчатом.

1. Это Вы градиент имеете ввиду? Можно ли через ступеньку, и без ультрацентрифуги?

Антитела проходят хорошо, но если дырявить 70% спиртом на -20 от получаса до суток (Apo-BRDU assay). Правда в этом методе фиксируют цельные клетки, а мне это нельзя.

Видел похожий протокол, дырявят 1% Тритоном, а потом фиксируют. Кто-то использует 0,5% Тритон, но тоже для нефиксированных. Мне боязно, т.к. ДНКа может слегка начать вываливаться, а тогда точно все в ком слипнется.

Честно говоря, мне кажется, что по большому счету простого пипетирования должно хватить. NP40 прекрасно лизирует ц/п мембрану и без вортекса. Наверное вортекс нужен для экономии времени, чтобы не пипетировать.

Вот и Tom1 говорил мне, что он выделял ядра через ступеньку сахарозы, только я процент/молярность забыл, а дозвониться до него не могу. типа Лизируем клетки, разбавляем и крутим через сахарозу.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3653551/
Вот еще протокол, но имхо, в пункте 3 маловато магния, а так, наверное подойдет. Только эти ребята не чистят ядра, что смущает.

Ультра для ядер точно не нужна - они же тяжелые, там сотни-тысячи g.
Градиент не помню - вспоминается около 2М сахарозы для нижнего, верхний - тот что писал. Все старые журналы все никак не оцифрую, а делал это в начале 90х

Если есть на чем "потренироваться" - попробуйте просто пару раз промыть осадок ядер как писал выше с уменьшением g при повторной крутке до 500-1000, получалось достаточно чисто.

Да, конечно буду сначала пробовать оптимизировать и поиграться с условиями. Собственно для чего топик начал - чтобы иметь какие-то отправные точки и сэкономить время и усилия.

Бугага!!! Услышал звон...
Вот как сочетанием слов "формалин" и "трансфак" можно вызвать злого МолБиольного духа, борца с формалином в любом топике.

Мне не надо картировать трансфак, все уже картировано до нас/Вас. Я хочу отсортировать CRISPR библиотеку относительно есть/нет транслокация трансфака.

2M - это подушка, или через нее должны проходить и падать на дно? Когда делал градиент, терзали смутные сомнения, короче ничего через 2М не прошло. В итоге собрал то, что плавало на границе, отмыл в 0.6М (прекрасно садилось на дно) пару раз, посмотрел под микроскопом - чачи практически нет, есть довольно чистые ядра.

Единственная проблема, больше половины их них окружено куском цитоплазмы (или ER, хрен его знает). Такое ощущение, что при лизисе (0.5% NP40) ц/п мембрану содрало, бОльшая часть цитоплазмы ушла, но то, что было вокруг ядра так и болтается вместе.

В любом случае, ядра зафиксировал 4% параформальдгидом в 1xPBS, отмыл, залил 70% (-20) этанолом до завтра. Завтра попробую покрасить на трансфак и посмотреть что получается на факсе и просто под микроскопом.

Подушка, насколько помню, в нее если и уходят, то совсем крупные ар-ты. Мы в микроскоп сильно не смотрели, мы потом гистоны мучали, да и с тритоном делали, так что тут - не советчик.

Вы ребяты из меня Третьякова сделаете.

Лизирующий буфер:
25мМ Трис 7,5
2мМ Mg
ЭГТА 1мМ - не обязательно
300мМ сахароза

Гомогенезировать обязательно в Поттере или Доусоне с тефлоновым пестиком.
Гомогенат пропустить через колготки или мельничный газ(но если культура клеток думаю это не обязательно)

Гомогенат крутить на 3000-4000g 20'

Собрать осадок. Осадок ресуспендировать в новом буфере
типа 1,8-1,9 М Сахарозы и тот же трис магний, что и в лизисе. Ресуспенлировать с помощью гномогенизатора(это важно).
Сузпензию нанести на подушку сахарозы в ультрацентрифужной пробирке подушка 2,1-2,2М сахарозы и все тот же трис -магний.

Ультрацентрифугировать 80000-100000g 50-70', собрать осадок под под подушкой - это ядра. Можно посмотреть в микроскоп на 40 и 100 с фазой.

Ядра (Осадок) можно ресуспендировать в холодном PBS и фиксировать.

Если вы хотите что бы ваша ДНК в ядрах осталась целой, а не покусанной на куски 300-1000нп, то Mg надо заменить на 5-10мМ спермин/спермидин с ЭДТА 1 мМ.

Ну и поддержу еще раз Третьякова очень сомнительно, что в ядра фиксированные формалином пройдут и свяжутся с трансфаками АТ. Может что-то и пройдет, но процентов 10 от силы от всамделешного количества.

1% NP40 в исходном протоколе это совсем не нежное выделение ядер. Очень много ядерных белков в таких условиях уже вываливаются наружу. По крайней мере частично.

И про поттер и про буфер уже писал выше и согласен на 100 (хотя магний хлора все же лучше 5 мМ, если конечно не имеется ввиду 2мМ именно по магнию). Что до ультра - оно может и правильно, но вполне обходились и без этого, но и задачи были другие.

Ну, по крайней мере, на вестерне (cyto extract) их не видно.

Ну меня тоже пока устроило без ультра-центрифугирования.

Спасибо, если не получится так, как я сейчас делаю, попробую как Вы советуете. Магний только оставлю, мне потом ПЦРить 200bp.
Насчет прохождения антител в ядро. В Apo-BrdU assay клетки фиксируются 1% параформальдегидом, пермеабилизуются ночь в 70% этаноле, отмываются, потом добавляется TDT с буфером, br-dUTP, достраиваются ds-DNA разрывы, затем клетки инкубируются с анти-BrdU-Alexa... и меряется все на ФАКСе. Я просто исхожу из того, что если все это может пройти в ядро, и чувствительности ФАКСа хватает, то и мне подойдет.

Возникла другая проблема. Фиксированные ядра после ночи в этаноле стали дико липнуть к стенкам пробирки и носика. Как следствие - потери примерно 90%.
Решение:
1. Заменить на метанол (20 мин/-20оС, но боюсь тоже самое будет)?
2. Заменить на 0.1-0.3% Triton?
3. Силиконизировать пробирки/носы (только не это!)

а что так долго пермеабилизация идет? ну например, при обычном окрашивании антителами, 5 мин метанолом на -20С, и этого хватит чтоб и фиксировать и пермеабилизовать

Ядра через 2М сахарозу на обычной центрифуге вы не продавите никогда 1,4-1,7М продавите на с грязью.

ДНК в ядре ооочень много BrdU ну допустим каждый 20-50 нуклеотид, примерно. Так что не проблема.

А трансфаков их мало сидят они в огромных белковых комплексах и с одной стороны прикрыты ДНК, а с другой белками. В общем могу только удачи пожелать в интерпретации того что вы там увидите.

Тритон может помочь не взамен, а в дополнение.

Согласен. Но надеюсь, что для NF-kB (в моем случае Rel-A) антитела все таки будут что-то красить, может не как на этой картинке http://media.cellsignal.com/pdf/8242.pdf но, все таки ФАКС должен прочесть.
На первый раз покрасилось конечно хреново, под микроскопом я ничего не видел, но ФАКС реагировал. Не так конечно, как хотелось бы, но разницу можно было видеть. Правда есть вероятность, что клетки очень слабо ответили на обработку. А положительного контроля (обработка TNF-a) я (идиот) не сделал, понадеялся, тчо сработает. Завтра повторю со всеми контролями. ЧТо понял на этот раз - буду дольше инкубировать с антителами.

помог

А там можно 30 мин, но можно и оставить в спирте до нескольких дней, а я ядра только фиксировать закончил к вечеру (обработка клеток долгая)

Короче все вроде нормально красится, контроли работают. Осталось отработать разведение антител и поиграться с факсом, чтобы пики лучше расходились.
Однако теперь мое главное опасение - ядра сильно слипаются. Причем сильнее начинают липнуть после пермеабилизации. 0.3% тритон не помогает. После всех инкубаций с антителами, чем дольше стоят, тем больше липнут, даже в микроскоп можно не смотреть. Лишнее пипетирование только сильнее рушит ядра.
Понятно, что на факсе можно установить какие угодно гейты, но все же хотелось бы как-то уменьшить % комков.

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ

https://forum.index.hu/User/UserDescription?u=1915158
https://forums.prosportsdaily.com/member.php?1210259-merry55
https://guides.co/p/merry-ja
https://linktr.ee/merryhere
https://blogfreely.net/merryja/the-identifi...he-gujarat-real
https://marketingfacts.nl/profiel/243079
https://members.theartofsixfigures.com/memb...erry99/profile/
https://my.archdaily.com/us/@merry-ja
https://my.scorecloud.com/user/4ba5cfa66b9b...c02b860e/merry1
https://myblogu.com/profile/imerry
https://postgresconf.org/users/merry-ja
https://rabbitroom.com/members/imerry77/profile/
https://seedandspark.com/user/merry-ja
https://skitterphoto.com/photographers/33982/merry-ja
https://starity.hu/profil/322068-merry22/

The best way to help บาคาร่าออนไลน์ our students to overcome slot xo the challenge of writing 11hilo in any genre is to help them สล็อต to break things down into their 123GOAL give them a basic formula to follow.

In this article nigoal we will break article writing ลิงค์รับทรัพย์ down into its component พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง particularly those that ราคา บอล parts and present a formulaic Hotgraph for our students to follow.