Коллеги!
Помогите.Нужна любая проверенная и работающая кольцевая плазмида для проверки компитентности клеток, поскольку в своей плазмиде не уверены. помоги, одолжите совсем чуть-чуть)

Вы бы хоть написали, где находитесь, для начала )

))Черноголовка,Московская область, конечно же в Москву приеду)

такой подход для определения компЕтентности клеток не работает. Потому что, если быть совсем точным, Вам нужен препарат в состоянии суперспирализации, а не просто кольцо (ибо кольцо содержит N разрывов и не годится для измерения компЕтенции)- стало быть, плазмида должна быть чищена на цезии и быть совсем свежей. Ну и где Вы по нынешним временам такую найдете?

Никому не нужны точные цыфры. А примерно компетешки можно проверить на любой плазмиде. На заре туманной юности я готовил десятки раз компетешки. но потом понял, что мой героизм нафиг никому не нужен. И стал заказывать клетки у Инвитрогена. В комплекте к клеткам всегда была контрольная плазмида. Первое время я еще хранил эти контроли. Но после того, как у меня скопилось больше 30 одинаковых пробирок pUC19 я стал их выбрасывать. Был бы в Москве с радостью поделился бы этим мусором.

то есть Вы предлагаете заказывать компетешки на Инвитрогене в Москве? Смешно. Шутка дня. Тогда уж лучше купите компетешки на Евроген в Москве, и то дело

Я не предлагал заказывать компетешки в Москве. В Москве я их сам делал. И химические и для электропоратора. Но я не в Москве и мне просче их сегодня заказать, а завтра они будут стоять у меня на столе. Я о контроле. мне его дают в нагрузку. И он мне нафиг не нужен. поэтому я его просто выбрасываю. У меня плазмиды 14kb. Пересчитать эффективность на pUC просто не возможно.

однозначно. но страждующему товарищу эти соображения не помогут

Viki, у Fermentas pUC купите -как раз в том виде что нужно. А вообще RJDio прав-если у Вас ТАКИЕ проблемы, купите все у Еврогена.

(мысли по поводу)RJDio, думаю правильно советовать неопытному товарисчу тесты в обстановке приближенной к боевой: т.е. если соискатель будет всегда заказывать компетешку в Еврогене, а лигирование выделять через цезий, то и да. А если человек будет готовить клетки сам и выделять лигирование переосаждением 1мкг вектора на образец (выделел. щелочным),- то так и надо определять и считать именно это компетентностью в конкретной лаборатории.

Товарищи!!!спасибо за комментарии. я в этом вопросе новичок конечно.
Проблема в том, что получив компетентные клетки CaCl2 и проведя трансформацию с pbr322 на чашках ничего не выросло. нам не понятно что не так, что-то с компетентностью или с плазмидой. понятно,что можно все купить и не париться, но возможности пока нет, поэтому разбираемся сами((подскажите что может быть не так в самостоятельной работе. компетентность проводим с CaCl2. трансформация тепловым шоком при 42..все по стандартным методикам..но не идет.

Наиболее частая ошибка новичков- перегрев в процессе готовки кальциевой компетешки. Проверьте плазмиду на форезе и если все нормально переделывайте компетентную.

если не растет вообще, а вы еще и новичок, то причины могут быть разные, вплоть до направильно разведенных плазмид, не того антибиотика на чашке.
если вы дадите хоть немного деталей того, что вы делали, то есть вероятность что вам тут подскажут в чем проблема. Ибо у меня даже студенты на практикуме делают кальций хлором клетки 10 в 5, и клоны растутосле трансформации.
сколько плазмиды брали в трансформацию? вы уверены что pBR это именно она?

Плазмида точно pbr322, на форезе проверяла все ок. антибиотик ампицилин. штамм DH5a

методика компетентности и реактивы следующие:
TB:
60mM CaCl2
15% глицерин
10 mM Tris pH7.4 (пробовала и с Нереs 10mM pH=7.4)

(компетентные клетки высаживала на чашки..все хорошо растет).

выращиваешь бактерии до плотности суспензии 0,4 при 590нм. потом во льду 5-10 минут. потом крутишь 1600g при +4, затем добавляешь CaCl2, ресуспендируешь и 5 мин при 1100 g при +4, снова CaCl2 и инкубируешь 30мин, открутка 5 мин при 1100g, затем разводишь осадок в 2 мл CaCl2 и по аликвотам замораживаешь жидким азотом и на -70.
трансформация:
на 100мкл замороженной суспензии добавляю 10нг плазмиды. 10 мин во льду.затем тепловой шок 42 в течении 2 минут.затем в лед и добавляю среду LB и час на качалке и посев на чашки с антибиотиком.

сейчас вот пробую трансформацию по стандартной методике Гловера с использованием ДМСО и ДТТ..может так получиться(

с 10 нг плазмиды должно много вырастать.
в принципе протокол обычный, но есть несколько моментов.

Кальций хлор обычно берут 100 мМ
морозите клетки в 15% глицерине? а то написали что в кальций хлоре.
Трис вообще нигде не фигурирует при пригшотовлении компетешек
убедитесь что центрифуга не греется при откручивании, у нас была такая проблема

по трансформации - добавьте 3 мкл ДМСО, перед добавление плазмиды.
на льду держите 30 минут,
и вот хит шок 2 минуты - вот это мне кажется очень долго, может изза этого ничего не растет.
60 сек - более чем достаточно

ну и еще вариант- изначально чтото не то с самим штаммом.из этого конкртено стока штамма ктото делал успешно компетентов?

так по-порядку)
вообще протокол взяла тот что использовали люди лет 10 назад и все получалось. оттуда и концентрация CaCl2 и морозили они компетешки именно в ТВ. Трис брала потому что не нашла Pipes.холодильник центрифуги работает точно.а тепловой шок пробовала при этих же условиях и 30 секунд, не помогло(а из этого штамма компетенты делали, но опять же давно((вот сегодня провела трансформацию с ДМСО завтра узнаю получилось или нет.))
а как нужно замораживать компетентные клетки если не в ТВ?

Я не спецалист в мол.клонировании, но немного приходилось. Правда, использовали электропоратор: что-то хим.метод "не пошёл", а вот о Эппендорфовском еПоратор'е только приятные воспоминания. У Вас в соседних лабораториях точно нет подобного прибора на "погонять"?
Но точно помню, что компетентные клетки замораживали и хранили в глицерине.

Электропоратор в планах купить))но не скоро))рядом к сожалению нет((
а по-поводу заморозки в моем ТВ есть глицерин же.интересно, он может мешать компетентности?(

Наверное я неправильно замораживаю клетки((я лузер((

Что у вас за антибиотик(в смысле кто производитель) в какой концентрации его добавляете?
Тот же вопрос про хлорид кальция какого он качества. Реактив советской квалификации чда к примеру не подходит. Мы для трансформации используем только кальций для инъекций из ампул.

попробуйте для замороженных клеток использовать одну из методик из книги Гловера ("Методы в ..."), самая менее требовательная к качеству реактивов процедура с использованием растворов RF1 и 2- найдите такую. Не надо DMSO методик, качество DMSO часто критично
НО!! если с 10 нг (а также пг!) не растет ничего, косяк однозначный либо собственно в методе трансформации, либо в приготовлении компетешек. Скорее первой, потому что угробить клетки, чтоб с 10 нг на росло- это надо сильно стараться

Концентрация антибиотика 100мкг на мл. вот за качество не знаю(
за хлорид кальция я сама вот сомневалась, поскольку скорее он старый. в банке не нашла осч. взяла готовый какой был в холодильнике((мысли о качестве тоже посещали. а ампулы можно свободно купить в аптеке да?

если ампицилин, то неважно, сколько его добавлять, клетки его прекрасно едят, поэтому что 50, что 500, разницы не будет.

Да, прямо в аптеке, продается, стоит сссущие копэйки.

Антибиотика уменшите в 2 раза. 100 многовато будет.

Удачи. Да, и воду для растворов ТБ(буфера трансформации) лучше бидистиллят или деионизованную.

А еще PIPES можно смело менять на HEPES,MOPS,MES, что найдете.

мы амп аптечный- а какой еще!- пользуем 200, все нормально, иначе вторичный рост идет часто. Вода в идеале MillQ

Спасибо ребят большое)))
воду итак беру первого класса из милипора)PIPEs как раз меняла на Hepes.
Будем пробовать))

Ну, товарищи, развели антиквариат. Я последний раз их делал лет давдцать пять назад, наверное. У меня ещё валяется где-то хлористый рубидий Раствор кальция хлористого можно автоклавировать. Нужен очень чистый - это верно Ошибка может быть любой - тоже верно. ЦезиЁвые плазмидки, полежав сколько-то лет, имеют отвратительное свойство разваливаться на глазах. Не знаю, почему. Антибиотика хот 200, если это ампициллин. Среда некачественная тоже может влиять, как и агар.

В общем, бросайте это дело и ищите электропоратор. Бу или попроситься, если на новый нет денег. Инвестироваться в наше время в кальциевые клетки - лучше вообще тогда пирожки продавать, честно говоря. Даже лучше будет результат с пирожками.

Попросите денег у начальства , купите в Еврогене компетентные клетки !!!!! Если Вы новичок , не было опыта и непосредственного учителя , у Вас не получается трансформация , нет денег на фирменные реактивы, то нет смысла идти в клонирование , там проблем будет еще больше!! Поищите знающего человека , кто делал клонирования генов и оформите хоз. договор на роботы.

Если вопрос все еще актуален, то приглашаю вас к нам (Москва).
Попробовать свою плазмиду на наших компетентных клетках, поучиться делать компетентные клетки, попробовать нашу плазмиду на своих компетентных клетках.

https://jumpshare.com/v/QxZ9Rn2mfDCaBq2AdBG1
https://www.edocr.com/v/znnrba3z/watcheshut...lica-Watches-UK
https://www.tuugo.us/Companies/best-replica...s/0310006695505
https://topsitenet.com/article/988178-hints...ca-rolex-watch/
http://simp.ly/p/nxGlWb
https://telegra.ph/Hints-on-Choice-of-a-Hig...lex-Watch-02-22
https://replicarolexwatche2.blog.fc2.com/blog-entry-1.html
https://www.knowpia.com/s/blog_60f7e7c31014a97a
https://zenwriting.net/replicawatches24/hin...ica-rolex-watch
https://globalcatalog.com/replicawatchesuk.us/en
http://www.cplusplus.com/articles/iE1wvCM9/
https://eatsleepride.com/c/346210/hints_on_...ica_rolex_watch
https://www.myminifactory.com/users/watcheshutukcom
https://www.mioola.com/ReplicawatchesUK/post/199764/
https://en.gravatar.com/allreplicawatches24
https://8tracks.com/replicawatchesuk

Anyone can connect บาคาร่าออนไลน์ with their audience slot xo through blogging and enjoy 11hilo you who your readers are. สล็อต the myriad benefits that 123GOAL blogging provides

organic traffic from nigoal from the first sentence.ลิงค์รับทรัพย์ search engines promotional พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง content for social media ราคา บอล and recognition from a new Hotgraph audience you haven’t tapped into yet.