Добрый день. переехал в новую лабу с новыми ванными для гель электрофореза. при разгоне ампликонов и размерного маркера у меня исчезают все фрагменты меньше 400пн как в маркеры так и в образцах... не могу понять с чем это связано. гель 1.2%. пробовал добавить больше бромистого - итог такой же. подскажите если кто сталкивался как можно решить данную проблему. при разгоне на старом месте работы все проходит хорошо.

А после фореза не пробвли докрашивать гель??

А с буфером внизу все хорошо?

да все отлично. 1 кратный тае.

нет еще отдельно не пробовал. но и сам факт постоянной докраски после каждого фореза приводит меня в состояние печали.

Если вас так парят подобные факты, то надо уходить, ну и 1.2% не для разглдывания 100нп по крайней мере не при разгоне на весь гель.

куда уходить? зачем? я хочу решить проблему. а разгон и в 1% геле даёт хорошие результаты в размерах 100-400. постановка идёт с rapd праймерами и мне важно видеть все бэнды.

Если реактивы и протокол тот же, а поменялась лишь камера - всё должно быть ОК. Проверьте всё - может буфер "косячный", или заливаете как-то не так, или ток выставлен другой. Вообще странно, как Вы говорите что и на ладдере (вопрос - какой на картинке?) нет лёгких фракций.
Предположение - короткие фрагменты у Вас точно не "убежали"? Попробуйте время фореза уменьшить. Я сам крашу гель после фореза (да, брезгливый - не люблю в БрЭт пальцы сувать). Попробуйте "погонять" ненагруженный красителем гель и покрасить (подвижность фрагментов при интеркалирующем красителе тоже может меняться).

-- куда уходить?
Куда - это ваше дело, а вот откуда, то это из лаборатории.

--я хочу решить проблему.
Это хорошо! Но без труда не выловишь и рыбку из пруда. Преодоление печалей входит в работу, над собой и над объектом эксперимента.

-- а разгон и в 1% геле даёт хорошие результаты в размерах 100-400.
Угу, ну прям, блестящие. Не надо делать дальнейших попыток меня в этом убедить.

Что бы вы не делали, RAPD никто и никогда не делает на большие длины фрагментов. Так шо, звиняйте.

Зоны исчезают по трем причинам:
1)Нет Бромистого этидия
2)Зоны размылись во время фореза
3)Зоны деградировали

Теперь ваш ход: Какие действия нужно предпринять, что бы устанновить, какие именно из этих трех причин являются причиной ваших неприятностей?
Жду ваших предложений.

Буфер свежий и точно не косячный. Сделал сегодня постокрашивание в отдельной ванне. Результат тот же - нет фрагментов меньше 500 ни на леддере ни в образцах. На картинке леддер слева самый первый соотвественно длины 1000-900-800-700-600-500 и больше не видно, хотя он должен доходить до 100(проверен в другой лабе). Вот ваще уже сломал голову не могу понять что не так. разгоняю при 120V. Перегрева геля нет так что не сварился.

Выше прикрепил снимок сделанный с постокрашиванием. Изменения не наблюдается. Опять же деградация зоны может быть связана в основном только с перегревом геля чего так же не происходило. гель свежеприготовленный. Бежать ни из какой лабы я не собираюсь так что буду искать решение хоть как. Размытые зоны можно было бы наблюдать на леддере если бы фрагменты просто рассредаточились - а там просто даже следов наличия коротких фрагментов не наблюдается. По поводу Rapd можете видеть на снимке наличие бэндов свыше 1тпн и 2х тпн.
Убеждать я Вас ни в чем не намерен. Это личной мой опыт и я имею по нему хорошие результаты. Только вот в связи со сменой лаборатории как уже говорил нужно вернуться в прежнее состояние чтоб все работало как часы.

Ну , как бы дело ваше, это я насчет 2000 нуклеотидов на RAPD.

А с маркером то что делать собираетесь? Деградация и перегрев - это ерунда полная. Перегрев не может быть основной причиной деградации.

То что вас у вас маркер и трети геля не занимает - это тоже конечно блестящий результат.

Кстати, сколько времени вы докрашивали и сколько маркера наносите,?

То что маркер не занимает трети геля это поту что во первых там всего 5 фрагментов которые прокрасились. Во вторых естественно будет использоваться второй маркер до 10тпн т.к. этот представленный маркер должен быть 100-1000пн. И это только прикидочные гели. сейчас мне главное разобраться куда девается малая фракция леддера. ЗА этим я и обратился на форум - за помощью. Ок тогда с чем может быть связана основная проблема деградации нижней части геля? Наношу 5мкл леддера. На старом месте работы иногда наносили 3 и все было блестяще.

Может быть, камера криво стоит?

Ого 5мкл!!!

--Ок тогда с чем может быть связана основная проблема деградации нижней части геля?
Да с чем угодно.

Маркер стух, агароза галимое г.

Вы все таки сделайте 2% агарозу нанесите ведерко маркера например мкл 10-15 и гоните гель где-нибудь нв 2/3-3/4 от всей длины, потом докрасьте этидием и посмотрите что получится.

агарозный гель не ровный, не выставлен по горизонту, ДНК выходит в буфер, гель разной толщины.

И возможны и другие причины, связанные с самим блоком для электрофореза.

По поводу RAPD, то очень плохое качество, ПЦР делаете неправильно, много ПЦР циклов.
По этим ампликонам ничего сказать будет нельзя, размыто и ПЦР давно уже закончилась, только размывание полос и происходит.

По поводу RAPD 38 циклов 10пкмоль праймеров смесь с немного увеличенным содержанием магния и +дмсо 1% полимераза SD 6 еа на реакцию. днк растительная 20-40 нг на реакцию. Сам факт что у меня есть уже красивые разгоны этой же постановки в другой лабе поэтому и решил поработать пока что с известными постановками с чем работал до этого и знаю какой должен быть результат в итоге. в этой новой лабе просто треш какой то все делаю так же как и ранее но результаты абсолютно не те. Меня просто поставили куратором чтоб наладить тут исследовательский процесс. Лаба с нуля. гель при застывании стоит на отрегулированной подложке. толщина геля приличная что бы был вариант выхода ампликонов в буфер.

ок завтра сварю плотный гель и попробую прогнать. Поделюсь результатом.

НА счет тухлого маркера нет варианта носил его на старое место там поработали сказали все гуд. Агароза хеликоновская, только с ней и предпочитаю работать нравится их качество. Один оладушек нет вариантов сейчас получить другой маркер и другую агарозу.

Про длину волны транслюма ничего не сказано.

Прошу прощения, но этот фокус с этидием типичен. Современные камеры для фореза делают небольшого объёма. Да ещё и хвастают низким расходом форезного буфера. Для коротких пробегов и обычной ПЦР это не имеет значения, но гнать форез до конца геля на малообъёмных камерах не стоит. К концу фореза идёт встречный фронт закисления, вызывающий размягчение и деформацию геля. Да и весь этидий убегает. А если и не убежит, то в кислоте светиться не станет.

Так что найдите в закромах заброшенную самодельную форезную камеру с большими отсеками для буфера. А если не найдёте, то придётся наладить его циркуляцию с помощью перистальтического насоса. Или просто периодически переносите часть буфера из оного отсека в другой.

Вообще от 100 до 400 пар гоняются в акриламиде. 19:1 и 40:0,5 в пополаме, 5-7%, нужно подбирать. И никаких таких проблем не будет, в нормальном приборе сейчас нижняя камера такая, что хоть до верху геля буфер заливай.

Про 1% агарозу, это, конечно, открытие дня.

Да что вы зациклились с этим 1%. дело не в том что я гоняю 100-400 а в том что с самого стандарта исчезают данные полосы. естественно если я вижу обилие коротких фрагментов варю 2% гель и переразгоняю. а тут сам факт полного отсутствия малых фракций. в этом заключается вопрос. про камеру конечно я не знал и это хоть какая то правильная мысль.

Спасибо. действительно ранее работал с более объёмной камерой и не понимал почему используют это старье))). сегодня заказал камеру на объем 2л. на счёт этидий пробовал и докрашывание в течении 2х часов вымачивать результатов не дало. про встречную диффузию тоже вчера прочитал в литературе

Еще и формы непонятной эти приборы - потому я и спросил, про буфер ибо больше всего похоже именно на фронт закисления, хотя характерной "волны" по гелю не видно, возможно гель толстый. Трис-борат ведет себя получше в таких камерах или, как тут посоветовали, банально перемешать буфер через 10 мин фореза.

У трансилюминатора фильтр тоже не фонтан, зря фотографируете без оранжевого светофильтра

для рабочих снимков есть geldoc doc xr+. а транс просто для наглядности. по поводу буфера тоже прочитал что лучше тбе так как он более плотнее и рекомендуют 0.5х

1.)На 1% лучше чем так (см. фото от Fermentas)Вы все равно не получите. В маленьких камерах хуже, но не принципиально, да фронта не видно значит не из-за этого.
2.)Если используете TopVision Agarose Tablets, то меньше 500bp и не увидите часто. Я не знаю что они туда мешают, но часто бывают партии где сразу после 500пар полоски исчезают. Уже не используем их.
3.) Лучше пользуйте Sigma или Roth NEEO Ultra-Q. И да, 2%

Тем кто пишет что дело в процентовке геля пишу : Сегодня прогонял в 2% геле 3 разных стандарта. Результат абсолютно идентичен предыдущим. Пробовал разогнать при вольтаже 60 и 80. Опять же отсутсвует фракция меньше 400. Буфер свежий. Агароза Helicon не истек срок годности. В общем задачу так и не решил до сих пор.(((( я в отчаянии

Ещё раз (был вопрос от RNK и меня) - а горизонтальность камеры вы проверили? Гель может быть ровным, но если в геле - неглубокие карманы, а камера стоит с наклоном, то мне кажется, что можно получить такое закономерное убывание яркости полосок маркера и потерю переднего фронта.

UPD: Хотя на второй вашей картинке нет такого убывания яркости полосок в маркере, как на первой. Там всё равномерно.

написано всего много, читать неохота. что заметно так -это то что у вас везде шмер, и в дорожках с маркером тоже.
я бы поставил ваши пцр точно также как вы и делаете, а затем половину реакции прогнал на форезе в вашей лабе, в тех же условиях что на картинке, а половину реакции в любой другой лабе.
если конечно вы так уже не делали.
сразу будет ясно есть проблема с агароза, буфер, заливка геля, камера и прибор.

срок годности агарозы вообще не влияет, ну если ей нет 20-30 лет. м

Надо к вам в лабу идти чудес не бывает. Вы упускаете какой-то момент. А мы его не можем предположить. Потому что мы не видим что вы делаете.

Все еще пользуюсь "Реаналом" 83-85 года для всякой "чернухи" - никаких проблем

Все же первое что бы проверил и переделал - буфер (и сделал бы ТБЕ, а не ТАЕ), дело 5 минут.
Потом поперемешивал бы буфер при форезе, не наливая больше пары мм над гелем.
Ну и вообще из области фантастики - с блоком питания все нормально? Стабилизацию по току не пробовали ставить, может буфер выдыхается и ток растет непомерно и мелкие улетают от локального нагрева?

Я вам не про 1%, в первую очередь, а посоветовал полностью изменить систему, чтобы получить результат. Но у вас, видимо не результат в приоритете, а доказать свою "Правду". Или, банально, нет вертикальной камеры. Пожалуйста, это ваши проблемы.

PS К тому же, акриламид даёт возможность добиваться высокого разрешения на TBE. А если это у вас TAE (как я предполагаю), то скорее всего это фокусы его закисления. Поставьте перистальтический насос для перекачки между + и - камерами, чтобы убедиться.

Оффтоп он

Акриламид тут тоже ИМНО совсем не вариант. Предлагаете 3000-800 bp тоже в нем гнать? Куда проще прогнать паралельно в 1,2+2%, чем с акриламидом возиться. Десяток- полтора полос RAPD прекрасно и в агарозе можно разделить в 99% случаев.
Еще можно извратом заняться 2/3 верх 1,2%, низ - 2%, но это точно изврат, хотя когда-то классические "Джефриссовские" фингеры так делали и неплохо получалось.

ребят, а если буфер на аноде истощается, не может ли ЭтБр как-то локально дохнуть?

а, я допер! на аноде образуется щелочь, в которой денатурируются короткие ДНКи. т.е. топикстартер банально перефореживает

а, нет, простите, про анод набредил

Нет проблем залить градиент по проценту акриламида и соотношению акриламид-бис одновременно. И будет вам от 100 до 3000, больше, правда, не влезет. Наверное. Но я говорю про акриламид в связи тем, что нужно понять, в чём проблема, а потом решать её. Я люблю сразу изменять условия на заведомо альтернативные, а потом что-то упрощать. Мне так удобнее. Но я вообще не стал бы так ставить эксперимент, речь сейчас не об идеологии, а о решении вопроса методом исключения.

ТАЕ вообще терпеть не могу, начиная с геномников в 80-е годы

МММ прав, надо глазами смотреть, что и как происходит, а то как на шоу иллюзиониста- опаньки- и полос нету. Есть какой-то системный косяк. Понятно, что не в RAPD дело, если низы есть, они не могут не есть. Разве что сделать ПЦР, прогнать в новой лабе, сделать фото, пойти в старую и прогнать те же образцы, и сравнить side-by-side. Чудес не бывает

В общем как бы идиотски это не казалось- дело оказалось в агарозе. вот такой вот бред... столько сил и средств убил за эту неделю...

приятно слышать, все так и есть чудес не бывает.

Спасибо, что сообщили, в чём же там был прикол.

Больше 30 лет форезю , но такого - никогда! Каких только не было у меня агароз в жизни , и отличались они качеством разделения, фоном (волосики, опилочки), запахом, цветом и т.п...
Хочу сказать, что НЕ ВЕРЮ! Или в Хеликоне тиграм мяса не докладывают?
Последний совет - не забывайте добавлять в буфер этидия.

Есть и другое мнение
За 26 лет форезов могу на пальцах пересчитать разы когда добавлял бромистый в гель/буфер.
Идет медленее, "расплетает" не всегда, полосы получаются шире, руками лазить без перчаток уже не захочется. И все ради экономии 10 мин послефорезной окраски (которая опять же съедается более длительным форезом) и чуть более яркими полосами?

А у меня был переносной транс и форез получался в режиме "риал тайм". плюс еще несколько мин.
Но для Саузернов, конечно, делал исключительно по Маниатису.
А что молодое поколено в этом понимает!

за 30 лет могу по пальцам (или не могу) подсчитать, когда НЕ добавлял этидий в буфер. Что за комиссия, Создатель!?

Дежурная перекличка старперов на тему какой целофан для цветов нужно взять для нормальной очистки белков и сколько раз можно использовать порезаную газету "Правда" для блотов

от 07.11.

Могу Вам отдать эту несчастную банку хеликоновской агарозы попробуете сами))) кстати сейчас пользуюсь новокупленной агарозой и тоже хеликон но рабочая.

Спасибо за заботу, сейчас я не нуждаюсь. Пользуюсь исключительно SeaKem LE "для каждого дня", а "на выход" - NuSieve 3:1. От Лонзы. Рекомендую.

Отдам Вам несчастную банку барбитуровой кислоты, если Ваш многолетний стаж лабораторной работы > 30! В добрые руки! Даром! С богом!)))