Столкнулся со следующей проблемой: при оценке чувствительности клеток (MCF-7) к экстрактам из растений, с помощью МТТ-теста, у меня были аномально низкие значения оптической плотности (0,1 в контроле и соответственно ниже, при увеличении концентрации экстракта).
Кратко о схеме опыта: культивирование клеток в 96 луночной плашке (TC-plate 96-well, cell+ Sarstedt), 60-и луночный формат; плотность посева — 2 тыс. клеток на лунку; преинкубация 24 ч., инкубация с экстрактом в питательной среде — 48 ч.; далее удаление экстракта (аспирация), промывка PBS-ом (Gibco), внесение раствора МТТ в PBS-е (0,5 мг/мл) и инкубация в течении двух часов; экстракция формазана.
Решил визуально оценить состояние клеток на различных этапах. Преинкубация и окончание инкубации с экстрактом — все норм, распределение клеток равномерное, имеется градиентное уменьшение плотности монослоя при увеличении конц. экстракта. Потом решил оценить каждый этап инкубации с МТТ: т.е взял на мониторинг три из шести контрольных лунок и оценивал состояние клеток после удаления экстракта, промывки PBS и внесения МТТ-раствора. И вот тут вылезло следующее: при внесении раствора МТТ значительная часть клеток (визуально 30 %) слетает с пластика. Три оставшиеся контрольные лунки я не мыл и после удаления питательной среды загрузил туда сразу МТТ-раствор (все клетки остались на пластике). Лунки с раститрованым экстрактом делал как обычно: мыл и загружал МТТ (в конце обработки всего планшета посмотрел в микроскоп: там клетки слетают тоже). Спетрофотометр показал, что в промытых лунках оптическая плотность 0,2 — в контроле с промывкой и ниже — в опытных лунках. Три контрольные лунки без промывки показали значение OD 0,6.
Соответственно, я выделил несколько возможных косяков:
1. Сушка клеток во время промывки. Наименее вероятно, так как три контрольных лунки были обработаны меньше чем за минуту (секунд примерно 30), а клетки слетели все равно.
2. Действие экстрактов. Наименее вероятно, так как опять же клетки слетают и в контрольных лунках, которые я мыл (без экстракта).
3. Испортился PBS или МТТ. Наименее вероятно, так как в аналогичном PBS-е я растворял МТТ и загружал в непромытые контрольные лунки — и после 2-ух часов инкубации с ними все гуд.
4. Разница в температурах промывочного PBS и раствора МТТ. Более вероятно. Первый был комнатной температуры, а раствор МТТ я подогревал до 37 градусов. Хотя опять же, на мой субъективны взгляд, странно: неужели для трех промытых контрольных лунок хватило тех пары секунд инкубации с "холодным" раствором, чтобы поубивать 50 % клеток? Да и при рутинном культивировании я промываю флаконы таким вот "холодным" PBS-ом (перед трипсинизацией или заменой среды) и таких печальных последствий не наблюдаю.
Выводы и возможные пути решения проблемы:
1. Вероятно аспирационка слишком агрессивно вытягивает раствор из лунок. Соответственно, нужно убрать стадию промывки и в краевых лунках сделать бесклеточную раститровку экстракта, для контроля способности остатков самого экстракта восстанавливать МТТ до формазана и/или влиять на оптическую плотность раствора.
2. Греть промывочный PBS.
Буду искренне благодарен за критические замечания! Может кто-нибудь сталкивался с такой проблемой и нашел ее решение.
P.S. Надеюсь, что проблема была описана до приемлемой внятности
P.S.S. При первом взгляде кривульки выходят приличные: S-образность, разброс данных небольшой, однако имеет место явный косяк + скачки в значениях IC50 для одних и тех же экстрактов.