Про ЯМР мне известно, что с помощью его разрешено значительно меньше белков, чем при помощи кристаллографии, и что он не всегда даёт однозначный результат (что может быть, по-моему, вызвано разными причинами), но вот что давно уже меня волнует: неужели в кристалле белок имеет точно ту же конформацию, что и в клетке? Ведь кристаллическое состояние совершенно не естественно для белков: неужели компактная структура кристалла, где молекулы белка "прилипнуты" одна к другой не оказывает никакого влияния на его конформацию? Я, конечно, не говорю о больших искажениях, но ведь даже самые небольшие отклонения могут быть важны. Что на этот счёт думают специалисты?

Основным недостатком ЯМР является требование к относительно небольшому количеству атомов белка, дающим сигнал. Белки >~35 кДа, полностью помеченные 13C-15N - это плавающий предел практического определения структуры белка. Некоторые белки метят кусками по 100-150 аминокислот (как - отдельный длинный разговор), решают структуру этих кусков а потом из решенных структур "собирают" целую молекулу в 3D. Некоторые белки при высоких концентрациях (> 0.4 мМ) образуют гели - фундаментальное и непредсказуемое на данный момент ограничение метода.
"Однозначный" результат иногда гораздо менее ценен, чем определение того, когда "неоднозначные" структуры конформационного ансамбля становятся "однозначными". "Неоднозначность" - это тоже важная информация о структуре, которую нельзя получить ни XRay-ем ни криомикроскопией, где "неоднозначные", лабильные участки белка просто не диффрагируют.

Второй вопрос про шодство структур белка в кристаллах и в растворе было в общем показано экспериментально. Часть структур была решена в растворах и в кристаллах и совпадение оказалось достаточно точным. Многие ферменты, как ни странно, даже сохраняют каталитическую активность будучи закристаллизованы. Но никто не может это всё гарантировать с самого начала на 100%.

""Однозначный" результат иногда гораздо менее ценен, чем определение того, когда "неоднозначные" структуры конформационного ансамбля становятся "однозначными". "Неоднозначность" - это тоже важная информация о структуре, которую нельзя получить ни XRay-ем ни криомикроскопией, где "неоднозначные", лабильные участки белка просто не диффрагируют."
Что такое криомикроскопия - сейчас попробую поискать. А неоднозначность может быть вызвана просто недостаточностью информации полученной через ЯМР? (лабильность структуры - это я имел в виду, когда писал о "разных причинах") Вообще с трудом себе представляю как может выглядить ЯМР спектр белка: ведь спектр даже довольно небольшой, но "разветвлённой" молекулы может часто быть похож на лес пиков.

Уважаемый Хромоцентр, совершенно верно, спектр, где вдоль оси Х - химический сдвиг протонов, а вдоль оси Y - интенсивность сигнала действительно неразрешимо сложен даже для малого белка. Но разработаны такие методы цифровой фильтрации сигнала, когда возбуждается/фильтруется только один диапазон химических сдвигов, например - амидные протоны. Они передают магнетизацию или через J-coupling по молекулярным электронным орбиталям соседним протонам или через <5 Ангстрем пространства; регистрируются избирательно сигналы только этих дистанционных протонов (давятся все остальные фильтрами соответствующих частот регистрации) либо магнетизируется амидный протон, а сигнал регистрируется ОДНОВРЕМЕННО его + соседнего по связи углерода 13C + амидного азота 15N. Полученный 3D-спектр, в котором каждое объёмное пятнышко соответствует химическо-сдвиговой "подписи" триады РАЗНЫХ резонирующих атомов (регистрируемых на разных радиочастотах) из триады остова каждой аминокислоты. Поэтому количество пятен в кубе спектра примерно соответствует количеству аминокислот. Для присвоения каждой аминокислоте ЕЁ триады химических сдвигов в 3Д-спектре эти резонансы снимаются с взаимодополняющих соседних триад атомов, поэтому идя по сигналу от одного атома к другому можно "пройти" присвоениями сдвигов через весь аминокислотный остов кроме пролинов, которые зациклены. После остова присваиваются так же последовательно химические сдвиги атомов боковых цепей, растущих из известных сдвигов атомов остова. Когда >90% Химических сдвигов атомов молекулы белка присвоены, каждый атом становится меткой и изменением своего химического сдвига в пространстве сигнализирует об изменении химического окружения. Так как молекула белка - непрерывная, то даже при регионарной "болтанке", несвёрнутости, некоторых участков белка в растворе можно этот участок "пройти".

Когда большая часть химических сдвигов присвоена, наступает время для экспериментов по передаче магнетизации через пространство <5 A. Как только для большинства протонов белка явно найдены атомы (протоны), находящиеся от него не дальше 5 ангстрем (про это говорят, определены distance constrains, не менее 20 на атомы каждой аминокислоты, short-range - на соседние протоны той же боковой цепи, medium-range - на протоны соседних аминокислот, long-range - на протоны НЕблизлежащих аминокислот, оказавшиеся поблизости из-за близости боковых цепей некоторых аминокислот в третичной структуре), эти ограничения расстояний в количестве нескольких тысяч скармливают программе аннилинга, которая минимизируя энергию численно крутит и подгоняет ВСЕ атомы так, чтобы почти все экспериментальные ограничения расстояний удовлетворялись. На выходе обычно образуется семейство численных решений структуры, удовлетворяющей этим ограничениям расстояний. Чем больше ограничений расстояний найдено для локального участка белка, тем меньше будет среднеквадратичная разница между гомологичными атомами этого участка среди множества семейства структур. Для random-coil участков обычно mid-range и long-range отсутствуют, поэтому они СИЛЬНО далеко друг от друга в множестве семейства смоделлированных структур. Семейство структур и называется "структурой белка, решённого ЯМР". Я постарался попроще, если что-то непонятно - уточните пожалуйста.

Да, недаром у вас ник такой... Даже и не думал, что существуют такие сложные системы анализа - когда меня ЯМР учили, то давали в основном одномерные спектры какой-нибудь органической молекулы и - вперёд, по интерграци, расщепления и локализации пика. А в биомолекуляр... Ну теперь буду примерно представлять себе как там происходит, а то было... Большое спасибо за всё!
Только вот, минимизируя энэргию чего?

Минимизируя потенциальную энергию молекулы белка. Их есть несколько подвидов.

А, понятно, ещё раз спасибо. Ну, подвиды этой энергии - это уже... ну, чувствую, что уводит меня от вопроса слишком далеко в сторону. Принцып ясен (в общем).

По моему скромному опыту, кристаллические структуры часто лучше согласуются с данными RDC,
например, чем собственно ЯМР структуры.
Имхо, всё таки 2-х и 3-мерные ЯМР спектры надо записывать по много часов а иногда - дней, в течении которых заметно влияют систематические ошибки за счёт температурных градиентов внутри NMR probe (у каждого probe свои теплопроводные особенности) и как результат, небольшой конвекции образца. Кроме того бывает и radiation damping, дрейф поля (и lock тоже дрейфует), нестабильность pH образца и т.д.

А что такое RDC и почему оно рассматривается вами как будто как эталон?

Измерение RDC (Residual Dipolar Coupling) это собственно один из ЯМР методов, и поэтому логично предположить что его данные лучше согласуются с ЯМР
структурами чем с кристаллическими. Но оказывается что чаще происходит наоборот. Поэтому чтобы провести проверку новой структуры я обычно беру pdb файлы кристаллов и жидкости и затем измеряю насколько эти данные согласуются с RDC данными путём их обработки в Module.

хе-хе, РДЦ регистрируется теми же приемо-передающими трактами, что и джей-связывание, а к дрейфу пэ-аш и прочим бедам еще добавляется термодинамическая и химическая нестабильность решетки геля, дающая возможность эти РДЦ измерять

потому и данные блише к кристаллам - структуры, дающие сигнал в обоих случаях изменены решеткой.

К тому же я обычно использую только backbone data ...

amide RDC? Дык кроме них обычно надёжно и воспроизводимо измерить ничего и не удаётся... Они ведь самые сильные и присвоить их правильно - никаких проблем...

У моего образца было около сотни пиков в HSQC и проблем с назначением спектров не возникло. Но (возвращаясь к теме) действительно, RDC
измеряются от образца с добавкой геля и по своим свойствам он где-то между жидкостью и кристаллом, вообще говоря.

Хотел пару слов добавить со стороны рентгена.
Действительно, все молекулы в кристалле имеют значительное число контактов с соседними молекулами и это действительно может привести к небольшим (но иногда и большим) изменениям в конформации молекул. К счастью, это как правило изменения, которые могут произойти в реальной жизни, вроде относительных перемещений доменов белка.
Действительно, многие ферменты в кристалле способны проводить свои обычные химические реакции. Сейчас как раз таким ферментом занимаюсь.
НО! Нужно очень внимательно подходить к любым структурам, с которыми вы работаете. Как и в любых других экспериментальных методах все зависит от экспериментатора. Если вам надо только посмотреть общую структуру белка или РНК, то здесь проблем, как правило, нет. Однако, если вы хотите посмотреть что-то детально, на уровне контактов между атомами, то лучше работать с прямым эксперименталным результатом (а именно с электронной плотностью), а не с ее интерпретацией (моделью с координатами атомов).
В моей работе я много сталкивался с артефактами интерпретации начиная от неправильно "пристегнутой" от соседней молекулы альфа спирали и кончая пересекающимися цепями двух молекул в комплексе. А уж сколько ошибок секвенирования можно найти когда решаешь структуру белков...
Честно говоря, после таких казусов немного боязно работать с результатами различных биоинформационных исследований.

Ошибок секвенирования белков? Биоинформационных - имелось ввиду предсказание структур? Ну это вообще штука часто очень скользкая...

нет, ошибки капиллярного секвенатора - когда соседний пик большой и считается за себя и за соседа

а потом непонятно в структуре, почему у однои аминокислоты выросла боковая цепь другой, с которой один нуклеотид разницы в сиквенсе

Ясно, (о общем) что это за "подводный камень", спасибо.