Комментарии к постоянной странице сайта: Выделение ДНК из крови

Выделение ДНК из крови млекопитающих. Очистка ядер лимфоциты, обработка SDS и Proteinase K. Раздел Методы сайта molbiol.ru.

[font=Arial][size=1][color=maroon]

по ряду причин пришло время (для меня) ревизии методов.
после анализа нескольких книг (в т.ч. и маниатис, это на случай реплики - "смотри в маниатисе"), протоколов коммерческих наборов и многочисленных обсуждений на молбиол (штук 30 тем просмотрел) остались вопросы.

на сегодняшний день основная задача - выделение тотальной днк из органов мышей (селезенка, гол мозг, кровь, кожа, мочевой пузырь) для детекции днк возбудителя в пцр. возбудитель - бактерия (не имеющая клеточной стенки) с внутри- и внеклеточной локализацией.

вопросы:
1. есть ли смысл использовать ГИТЦ или все-таки протеиназы достаточно (до этого работали только с протеиназойК)?
2. от момента взятия органа до момента глубокой заморозки (-70) проходит до 5 часов. есть ли смысл в использовании фиксирующих или лизирующих растворов? спирт, ацетон, тот же ГИТЦ?
3. с кровью мне все ясно, а вот для органов, особенно с достаточно жестким соединительнотканным каркасом (мочевой пузырь) достаточна ли обычная концентрация протеиназы, или стоит попробовать увеличить ее?
4. в протоколах как присутствует, так и отсутствует этап экстракции смесью фенол-хлороформ (1:1). делали и так, и так. х.з., та и не опредилился - нужен ли он? какие теоретические предпосылки имеет этот этап?
5. в некоторых протоколах используют просто хлороформ, в других хлороформ-изоамиловыйспирт (24:1). есть ли особый смысл в этой смеси?
6. свежекупленный хлороформ квалификации хч пергонять не нужно, я думаю?
7. вот еще давно мучает вопрос - в лизирующих растворах используют гуанидин изотиоцианат, а почему хлорид нельзя? у меня вот большая банка гуанидин хлорида стоит. может не стоит деньги тратить?

1. Я бы поставил вопрос наоборот. С гуанидином-то быстрее
2. ГИТЦ, а если просто детекция возбудителя, то бросьте орган в холодильник
3. ддостаточно обычной концетрации, можно увеличить время
4. Если используете протеиназу, то отмывка фенолхлороформом обязательна, и вообще в любом случае она желательна
5. я разницы не видел
6. лучше использовать "для молеулярной биологии"
7. изотиоцианат лучше лизирует, а в остальном - пофигу

Изоамиловый спирт добавляют в хлороформ, чтобы смесь не пенилась - только и всего.

в смысле сначала фенолом, потом фенол-хлороформом, а потом хлороформом?

Пробовали выделять ДНК мышей разными методами (в том числе и с протеиназой с отмывкой фенолом). Пришли к выводу, что лучше всего работают киты (личное мнение). Сами пользуемся китом quiagen DNeasy. Результаты лучше.
Но это опять же смотря для каких целей. При работе с данным китом можно выделять только из небольшого образца. Если же требуется выделить ДНК из целого органа, то тогда вышеописанным методом.

Кстати о концентрации протеиназы К. Увеличивать точно не нужно, следует придерживаться концентрации, указанной в протоколе. А кроме увеличения времени можно еще гомогенизатором поработать.

Да. Причем фенол-хлороформ и хлороформ лучше повторить дважды. Так ДНК чище выходит.

а куда отраву, оставшуюся после перегонки девать?
на вид и на запах она покруче фенола будет, однако.

Если не мешает митохондриальная ДНК, то можно выделять еще более простым методом:
получить кровь из вены добровольца;
добавить 0.5M EDTA до 50mM => 1/10V;
добавит 0,8 V Tris Cl pH7.6 5mM (сток 1M), proteinase K до 50µg/ml,SDS 10% до 1% (1/10V) и инкубировать при 50С ночь.
А далее по Маниатису...

Выделение ДНК из крови очень реальное описано в МЕТОДАХ на molbiol.ru, только обязательно см. коментарии /Kola/. 100% работает! И николя2

Пункт 11 см. у Маниатиса, но изоамиловый спирт использовать не обязательно. Хлороформ можно брать и не перегнаный. Главное, чтобы перегнаным был фенол.
Пункт 12 - 96% спирт следует охладить до -20 иначе ДНК может и не выпасть в осадок. Чтобы избавиться от спирта лучше отбирать его просто пипеткой, а потом оставить в холодильнике на 1 ночь (но не более, инача ДНК потом не растворится), чтобы остатки спирта сами испарились и потом ДНК можно уже растворять в воде или хранить в сухом виде.

если в ПЦР - 20мМ КОH + 60% ПЕГ 200 потом прямо в рекциу 1:10

продается как DNAzol Direct

а если CGH на microarray - то совсем другое дело (

а еслы для детекции 8-охоG - то вообше (( (( ((

ну точно не фенол хлороформ (8-oxoG)

поетому вопрос могно ли выделит абсолутно интактнуу "днк" ис ОРГАНА
имеет отрицателныи ответ "НЕТ"

Подскажите, а есть ли какие-либо особые условия, при которых нужно готовить раствор протеиназы К?

Коллеги и просто сотоварищи! Очень нужна метода выделения человеческой, извините за выражение , ДНК из цельной крови, по чистоте, количеству и высокомолекулярности ДНК сравнимая с фенол-хлороформом. Типа разнообразных колонок и прочих буржуйских китов. Объем крови для выделения 5 ml. Ежели кто юзал и сравнивал, отзовитесь, плиз. Заранее всем спасибо

Коллега и товарищ! Обратитесь в Лаборатория Изоген по поводу набора для выделения геномной ДНК из цельной крови. Называется набор Diatom DNA Prep. Непревзойденное качество выделенной ДНК. Буржуйские киты отдыхают.

Это спасибо огромное. Только мне надо сразу из 5 мл выделять, а там, насколько я понимаю, максимум 200 мкл. Аликвотить довольно неохота, ибо образец будет не один, а сильно больше.

Для чего Вам такая прорва ДНК? Саузерны? Банк? За полчаса без центрифуги можно выделить ДНК из 1 мл цельной красной крови на магнитном сорбенте. Набор "Magnetic DNA Prep 1". Его же можно приспособить для выделения из большего объема, 2-10 мл.

Ну типа. Спасибо, посмотрю.

ИМХО наиболее дружественный протокол выделения ДНК у наборов Promega. ДНК получается чистая, процесс занимает всего час для крови и 4-5 часов для биоптатов.

я понимаю РНК на микроарреи - но зачем СТОКО ДНК ?

Это спасибо огромное. Только мне надо сразу из 5 мл выделять, а там, насколько я понимаю, максимум 200 мкл. Аликвотить довольно неохота, ибо образец будет не один, а сильно больше.

Киты QIAGEN Max - это то, что тебе нада

привет всем,

есть здесь кто-нибудь, знающий выделения ДНК из костей? сколько вы используйте костный порошок и как осаждайте ДНК? мне никак не получается осаждение ни с этанолом, ни изопропанолом?

спасибо заранее
Тамара

Вы уверены, что дело доходит до осаждения, может быть у Вас ДНК ваще не выходит из костной ткани?

1: Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Nov 7;97(23):12800-3.Click here to read Click here to read Links
Molecular identification by "suicide PCR" of Yersinia pestis as the agent of medieval black death.

* Raoult D,
* Aboudharam G,
* Crubezy E,
* Larrouy G,
* Ludes B,
* Drancourt M.

Centre National de la Recherche Scientifique Unite Propre de Recherche de l'Enseignement Superieur (UPRES)-A 6020, Faculte de Medecine, Universite de la Mediterranee, 13385 Marseille, France. Didier.Raoult@medicine.univmrs.fr

Medieval Black Death is believed to have killed up to one-third of the Western European population during the 14th century. It was identified as plague at this time, but recently the causative organism was debated because no definitive evidence has been obtained to confirm the role of Yersinia pestis as the agent of plague. We obtained the teeth of a child and two adults from a 14th century grave in France, disrupted them to obtain the pulp, and applied the new "suicide PCR" protocol in which the primers are used only once. There were no positive controls: Neither Yersinia nor Yersinia DNA were introduced in the laboratory. A negative result is followed by a new test using other primers; a positive result is followed by sequencing. The second and third primer pair used, coding for a part of the pla gene, generated amplicons whose sequence confirmed that it was Y. pestis in 1 tooth from the child and 19/19 teeth from the adults. Negative controls were negative. Attempts to detect the putative alternative etiologic agents Bacillus anthracis and Rickettsia prowazekii failed. Suicide PCR avoids any risk of contamination as it uses a single-shot primer-its specificity is absolute. We believe that we can end the controversy: Medieval Black Death was plague.

http://www.pnas.org/cgi/content/full/97/23/12800

как-не выходит? После 3-дневной декальцинации а потом 18-часового лизиса и центрифугирования остаётса крохотное количество порошка...Добавляю 2мл лизис-буфера и получаю 3,7мл лизата..

Декальниция должна быть с ЭГТА, а не с ЭДТА. А лизис-буфер для чего, с чем? Подробнее, пожалуйста. Используете ли Протеиназу К?
Я делаю декальцинацию с Тритоном Х100, 1%, на ночь, затем супернатант использую для сорбции ДНК на силике в присутствии с GTC. Вся ДНК, если она есть в зубной пульпе , Ваша

Дк в статъе про чуму написано - СНАЧАЛА ЗУБья пескоструем в гараже
обработать а уж потом ДНК выделять - ато СТО ПУДОВ сам-себя отпцришь

Возмите "внутрьАлу " праймеры (если человекообезяна с зубами)
и в ПЦР с сигмовской Ресторазой или "ЛонгПЦР" микс от Ферментас -
ну и сразу усе увидете

Restorase™ DNA Polymerase
PCR


Sigma's Restorase DNA Polymerase (R1028) is a specialty enzyme designed to facilitate repair and provide reliable amplification of damaged DNA. Extensive manipulation of DNA that results from archived samples, aged museum specimens, or samples from phenol/chloroform extraction, causes damage that interferes with accurate amplification during PCR. Restorase was developed for researchers unable to achieve amplification of damaged DNA templates when using other commercially available DNA polymerases. The ability to restore damaged or degraded DNA enables researchers to work with damaged templates that would otherwise be abandoned.

Нужно сразу ПЦРитъ как тока откопал черепушку - а не по музеям бегать
1: Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jan 16;104(3):739-44. Epub 2007 Jan 8.Click here to read Links
Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient DNA.

* Pruvost M,
* Schwarz R,
* Correia VB,
* Champlot S,
* Braguier S,
* Morel N,
* Fernandez-Jalvo Y,
* Grange T,
* Geigl EM.

Institut Jacques Monod, Tour 43, 2 Place Jussieu, 75005 Paris, France.

Despite the enormous potential of analyses of ancient DNA for phylogeographic studies of past populations, the impact these analyses, most of which are performed with fossil samples from natural history museum collections, has been limited to some extent by the inefficient recovery of ancient genetic material. Here we show that the standard storage conditions and/or treatments of fossil bones in these collections can be detrimental to DNA survival. Using a quantitative paleogenetic analysis of 247 herbivore fossil bones up to 50,000 years old and originating from 60 different archeological and paleontological contexts, we demonstrate that freshly excavated and nontreated unwashed bones contain six times more DNA and yield twice as many authentic DNA sequences as bones treated with standard procedures. This effect was even more pronounced with bones from one Neolithic site, where only freshly excavated bones yielded results. Finally, we compared the DNA content in the fossil bones of one animal, a approximately 3,200-year-old aurochs, excavated in two separate seasons 57 years apart. Whereas the washed museum-stored fossil bones did not permit any DNA amplification, all recently excavated bones yielded authentic aurochs sequences. We established that during the 57 years when the aurochs bones were stored in a collection, at least as much amplifiable DNA was lost as during the previous 3,200 years of burial. This result calls for a revision of the postexcavation treatment of fossil bones to better preserve the genetic heritage of past life forms.

PMID: 17210911 [PubMed - indexed for MEDLINE]

1: Mol Biol Evol. 2006 Sep;23(9):1801-7. Epub 2006 Jun 29.Click here to read Links
Tracking down human contamination in ancient human teeth.

* Sampietro ML,
* Gilbert MT,
* Lao O,
* Caramelli D,
* Lari M,
* Bertranpetit J,
* Lalueza-Fox C.

Unitat de Biologia Evolutiva, Departament de Ciencies Experimentals i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, Spain.

DNA contamination arising from the manipulation of ancient calcified tissue samples is a poorly understood, yet fundamental, problem that affects the reliability of ancient DNA (aDNA) studies. We have typed the mitochondrial DNA hypervariable region I of the only 6 people involved in the excavation, washing, and subsequent anthropological and genetic study of 23 Neolithic remains excavated from Granollers (Barcelona, Spain) and searched for their presence among the 572 clones generated during the aDNA analyses of teeth from these samples. Of the cloned sequences, 17.13% could be unambiguously identified as contaminants, with those derived from the people involved in the retrieval and washing of the remains present in higher frequencies than those of the anthropologist and genetic researchers. This finding confirms, for the first time, previous hypotheses that teeth samples are most susceptible to contamination at their initial excavation. More worrying, the cloned contaminant sequences exhibit substitutions that can be attributed to DNA damage after the contamination event, and we demonstrate that the level of such damage increases with time: contaminants that are >10 years old have approximately 5 times more damage than those that are recent. Furthermore, we demonstrate that in this data set, the damage rate of the old contaminant sequences is indistinguishable from that of the endogenous DNA sequences. As such, the commonly used argument that miscoding lesions observed among cloned aDNA sequences can be used to support data authenticity is misleading in scenarios where the presence of old contaminant sequences is possible. We argue therefore that the typing of those involved in the manipulation of the ancient human specimens is critical in order to ensure that generated results are accurate.

PMID: 16809622 [PubMed - indexed for MEDLINE]

1: Mol Biol Evol. 2005 Oct;22(10):2040-7. Epub 2005 Jun 15.Click here to read Links
Extensive human DNA contamination in extracts from ancient dog bones and teeth.

* Malmstrom H,
* Stora J,
* Dalen L,
* Holmlund G,
* Gotherstrom A.

Department of Evolutionary Biology, Evolutionary Biology Centre, Uppsala University, Uppsala, Sweden. helena.malmstrom@ebc.uu.se

Ancient DNA (aDNA) sequences, especially those of human origin, are notoriously difficult to analyze due to molecular damage and exogenous DNA contamination. Relatively few systematic studies have focused on this problem. Here we investigate the extent and origin of human DNA contamination in the most frequently used sources for aDNA studies, that is, bones and teeth from museum collections. To distinguish contaminant DNA from authentic DNA we extracted DNA from dog (Canis familiaris) specimens. We monitored the presence of a 148-bp human-specific and a 152-bp dog-specific mitochondrial DNA (mtDNA) fragment in DNA extracts as well as in negative controls. The total number of human and dog template molecules were quantified using real-time polymerase chain reaction (PCR), and the sequences were characterized by amplicon cloning and sequencing. Although standard precautions to avoid contamination were taken, we found that all samples from the 29 dog specimens contained human DNA, often at levels exceeding the amount of authentic ancient dog DNA. The level of contaminating human DNA was also significantly higher in the dog extracts than in the negative controls, and an experimental setup indicated that this was not caused by the carrier effect. This suggests that the contaminating human DNA mainly originated from the dog bones rather than from laboratory procedures. When cloned, fragments within a contaminated PCR product generally displayed several different sequences, although one haplotype was often found in majority. This leads us to believe that recognized criteria for authenticating aDNA cannot separate contamination from ancient human DNA the way they are presently used.

Все ссылки идут на этого чухонца Паабо, который заливал костяной порошок высокомолярным GTC. В таких условиях даже экзогенная ДНК (я добавлял ДНК лямбды-моделировал) пропадала по ходу выделения, т е прилипала к кости и навечно там оставалась. А ПЦР на древней ДНК - это отдельная тема

да фиг с ним Пабо Попробывал бы он ПЦРитъ после ОБЛУЧЕНИЯ
ДНК УФ импулъсным лазером (266 нм) мощностъю в три Хиросимы
такой "ДНК " на земле нет даже в виде нуклеотидов

Ресторазу ему, Ресторазу под хвост, как миленький пойдет

Зря ухмыляешся Тока что приперли из Индонезии фиксированную -перефиксированную гистологию и нужно было 550 бп хитрой
бактерюхи отпцрить - так тока "Лонгмикс" от Ферментаса вытянул

http://www.jhc.org/cgi/reprint/50/8/1005

Ну и купи себе медаль Ты сначала отсеквенируй ампликон, а потом хвастайся. А почему не Ресторазой любимой?

Я сколько раз говорил тебе, что рН и высокая температура спасет мир

не ресторазой - потому что хреновей ферментоса у меня
получатся а клонировать и сиквенировать - само собой
потому как праймеры - panVIBRIO

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlere...ubmedid=9770538

Привет . Здесь про твой любимый ТВ тоже в древных пробах.
http://www.454.com/downloads/news-events/g...mancientdna.pdf

ты меня этим ФИННСКИМ придурком уже достал у меня жена финнка и лютеранка
30 лет уже как веду православно-лютеранскую бойню но победы не видно

Сочувствую . А о себе я лучше промолчу