Предыстория. Достался нам грант, мне поручено в рамках отведенной суммы сформировать список оборудования/реагентов/расходников для ПЦР-кухни. Замечу, что тут я новичок почти что совершеннейший (вообще я биофизик,но, поскольку в лаборатории я единственный неполевик, то ПЦР возложат на меня), ждут меня курсы, конечно, но список-то уже сейчас надо сдавать. Сумма, увы, не так велика, как хотелось бы...
Приглядела я амплификатор MJ mini на 0.2 мл пробирки. В его описании (на сайте Helicon'а) указывается, что крышка с подогревом позволяет работать без минерального масла. Кстати, один из параметров, по которому он мне глянулся. Когда я стала смотреть по каталогам пробирки/стрипы, выяснила, что существуют вариации плоские/выпуклые крышки, причем последние в одном месте подавались как способ избежать использования мин.масла при работе с амплификаторами с нагревающейся крышкой.
Помогите разобраться - нагреваемая крышка таки исключает масло или нет? Или туда же в комплект надо выпуклые крышки? Или достаточно плоских? И вообще, какие крышки лучше и удобнее в работе?

удобнее плоские, ИМХО
можно подписывать.
а масло не надо ни в плоские, ни в круглые (т.к. крышка греет)

Мы предпочитаем плоские. Во-первых, из-за того же соображения, что и у предыдущего автора, а, во-вторых, при использовании небольшого количества проб, круглые крышки можно помять, иногда вместе с пробиркой.

Если финансирование невелико и никогда не занимались ПЦР, то начинать лучше с Терцика (~ 2 000$) или даже новой тульской модели (1000$).

To genseq:
А почему именно Терцик? Из-за того, что дает возможность 4 независимых амплификаций? И что за тульская модель?
А вообще с ПЦР мне предстоит следующее (для прояснения обстановки). Чисто детекция по типу есть/нет - не интересует.
1) определение гаплотипов mtDNA объекта исследования (Phytophthora infestans). Схема уже накатана, т.е. варьировать ничего не надо. ПЦР+рестрикция и форез. Это я уже делала и сама.
2) Начальству желается чего-нибудь этакого :-) чтобы как в приличных домах :-)) филогенетические деревья там строить, анализ внутрипопуляционных различий в генотипе (заветнейшая мечта всех, кто фитофторой занимается - привязать к генотипу фенотипические маркеры, такие как агрессивность, вирулентность штаммов и т.п... но пока ни у кого не выходит). Да, и еще желательно, чтобы это все можно было состыковывать с результатами зарубежных коллег.
Я тут уже вся в статьи закопалась. Завлабу AFLP желается, но не уверена, что вытянем по средствам. Кстати, ДНК-форез в полиакриламиде можно визуализировать этидиумбромидом? А то в статьях все авторадиография да флуоресценция с серебром (дорого это для нас, боюсь).
В общем, посоветовали мне тут. что надо либо single-enzyme AFLP тогда пробовать, чтобы мечения избежать, либо вообще работать на, скажем, SSR - для воспроизводимости и сравнимости.
Ощущения, блин...как на льду скользком. Теории не совсем хватает, практики - ОЧЕНЬ не хватает, чего хотят - не совсем понятно, а ты тут список составляй, да еще в смету уложись.

А почему нет? Этидию все равно. Делаете раствор этидия бромида (0.5 мкг/мл) в форезном буфере и кладете туда гель. Минут 10 и готово!

0. Бромистый этидий - не самая безвредная гадость.
1. В денатурирующем геле фрагменты ssDNA бромистым будут краситься не очень эффективно.
2. Как Вы собирались документировать и обсчитывать свои AFLP/SSR гели?

IMHO, фосфор (если под рукой есть изотопка) либо серебро. Это совсем недорого. Можно тупо взять протокол покраски отсюда: http://www.promega.com/tbs/tm023/tm023.pdf и попробовать. Вода - бидистиллят, форезные реактивы - чем качественнее, тем лучше, особенно мочевина, нитрат серебра - сойдет отечественный ЧДА

По части пробирок - для большого кол-ва проб лучше стрипы или 96-дырочные плашки.

Круглые крышки в ПЦР-пробирках нужны для того, чтобы в них не скапливалась жидкость, например - конденсат. В плоских крышках за счет сил поверхностного натяжения жидкость может оставаться. Допустим, если вы перемешали реакции перед постановкой и не отцентрифугировали пробирки, то в плоских крышках останется часть реакционной смеси, в то время как она скорее всего стечет вниз в пробирках с круглой крышкой. Если Вы планируете в дальнейшем переходить на real-time PCR, то для нее используются исключительно плоские крышки, так как через них производится измерение флюоресценции.

эээээ... для реал-тайма используются как раз круглые крышки :-)

Это вы откуда взяли? Наоборот, в Real-Time большей частью выпуклые пользуют, хотя и плоские тоже встречаются...

Спасибо всем участникам обсуждения (в т.ч. и будущим), вы многое мне проясняете. По ходу дела и сама дочитываю по статьям кое-что.
Real-time PCR вроде пока не планируем, честно говоря, не представляю, как его использовать для исследования структуры популяции. Вопросы детекции патогена - не стоят, моя работа будет заключаться в анализе изолятов, выделенных в лаборатории из привезенных со всей России образцов. То есть, патоген по определению присутствует, чего его искать :-)
Дополнительный вопрос - никто не работал с отечественными бидистилляторами? Как они в плане надежности и техобслуживания? Мне сегодня показали бидистиллятор Sanyo WSC 900 - хорош, ничего не скажешь, три года работает без нареканий, автоматическая очистка, короче, купили и работают себе, горя не зная. Стоит его аналог сейчас около 4000 евро. Попытаюсь его втиснуть в список, но на всякий пожарный присмотрела отечественный - за 102000 р. производства "Медиана-фильтр". Называется аббревиатурой УВОИ-МФ 14Ф(18)-1, дает бидистиллят 18мОм...
Насчет окраски серебром - вот хочу как раз тоже в план включить. Насколько я поняла, процесс примерно тот же, что и при проявке пленки? Судя по реактивам. Насколько хорошие реагенты для окраски нужны? Сойдут ли отечественные не только нитрат серебра, но и все остальное - тиосульфат, формальдегид, уксусная к-та и т.п.? Протокол у меня есть. Но что такое APC film? Как производится документирование результата - спец. оборудованием или достаточно подсветить и снять на цифровик?
Кто-нибудь пользовался MetaPhor-агарозой? Действительно ли она дает разрешение как полиакриламид? И почем она в Москве стоит?

Real-time машины Stratagene, Bio-Rad и ABI на которых я работаю используют пробирки с плоскими крышками. Smartcycler использует свой специальный пластик. Приведите примеры машин, на которых используются пробирки с круглыми крышками. Даже если такие машины и существуют, то у них измерение флюоресценции наверняка производится не через крышку, а через дно пробирки. Например - Nuclisens EasyQ, но это машина для NASBA, а не для PCR. Измерение флюоресценции через круглые крышки невозможно по логике вещей, так как вносит очень большую вариабельность из-за преломления света в пластике.

2Carbon Copy
у нас биорадовский рилтаймник и пробирки с крулой крышкой. детекция сверху.
просто на крышке есть плоскость для детектора...

И что? Попробуйте плоские крышки и почувствуйте разницу. Для машин с CCD камерой (каким является Bio-Rad iCycler) рассеивание света круглой крышкой не так критично, хотя наверняка чревато снижением чувствительности и кросс-засветкой соседних реакций. А если взять fiber optics машины, например Stratagene MX4000, то там луч света узконаправлен и при движении челнока не всегда попадает в центр пробирки - вот это настоящая засада, если крышка круглая. Интересно, а позволит ли мне MX4000 вообще использовать круглые крышки? Попробую сегодня, наверняка будет ругаться после тестирования. Она неплотно закрытые/перекошенные плоские крышки всегда видит и плюется, а уж от круглых ее сразу стошнит. Хотя, нет, не буду фигней заниматься, а то еще крышка не закроется, мотору тогда хана, а все из-за идиотского спора о круглоте/крутизне крышек.

Бидистиллятор БС можно достать за 35-40К деревянных, хотя в свое время банально перегоняли дистиллят в стеклянной посуде на обычной плитке и все работало - цена вопроса одна тыща рублей. Насчет серебра - да, отеч. химия сойдет, хч или осч. Na₂CO₃ придется поискать хороший источник или заказать Sigma ACS grade. Форезные реактивы вражеские. АРС - разновидность пленки, не заморачивайтесь. Для истории снимали на цифровик, но лучше всего иметь планшетный сканер с приблудой для сканирования прозрачных материалов. Для покраски подходят обычные фотокюветы большого формата - их кто-то до сих пор делает.

Да не, с финансами не настолько туго как раз в смете на оборудование дыра тыщ в 10-12 буказоидов обнаружилась, вот и постараюсь вставить Sanyo. Просто придется повоевать - народ кинулся радостно технику компутерную туда вписывать :-))
А за кюветы - отдельное спасибо, этот вопрос меня тоже занимал. Вот и пригодятся мои старые фотокюветы, забыла уже, когда ими пользовалась. Да и сканер такой у нас есть.

Тот же iQ прекрасно работает с круглыми крышками :-) Про Stratagene и ABI - просто не знаю, не работал :-) И наш отечественный реал-тайм - ДТ-322 - тоже работает с круглыми.. А через дно пробирки из реал-таймов меряет Rotorgene..

Определение "прекрасно работает" по отношению к Bio-Rad iCycler (как и почти всему ассортименту оборудования от Bio-Rad) НЕПРИМЕНИМО. Ну работает, если эффективность реакции и флюоресцентный ответ хорошие. Но, чувствительность у устаревшей CCD камеры просто дерьмо. Безапелляционность Ваших заявлений, учитывая что Вы ни на чем лучше iCycler никогда не работали, может вызвать только улыбку. Про круглые крышки на iCycler см. мой предыдущий ответ isotope.

to Carbon Copy - коллега, дайте тогда свое определение термину "прекрасно работает"... Если тест-система для количественного определения вируса гепатита С в клинике работает на данном оборудовании, дает воспроизводимые результаты при минимальном разбросе... какой я могу сделать из этого вывод? На мой взгляд - это прекрасно. НО по большому счету, речь у нас шла не об этом, а о круглых или плоских крышках. Я сказал свое мнение, при этом не претендуя на должность оракула... И это называется - безапелляционность? :-))) А что лучше или хуже - так это ж сколько людей, столько и мнений.. у каждого прибора есть свои достоинства и свои недостатки, поэтому, на мой взгляд, не существует прибора САМОГО хорошего - они все хороши, каждый на свой лад :-) ЧТо же касается работы на оборудовании - так можно и на не самом лучшем оборудовании получать прекрасные результаты, и наоборот... Поэтому тот факт, что человек работал на чем-то супер-крутом еще не говорит о его компетентности (это общее замечание, не намек на Вас)... Разве не так? :-)

Видите ли , dimkin, все познается в сравнении. Свое мнение о Bio-Rad iCycler я основывал на сравнении возможностей этой машины и software с другими перечисленными real-time инструментами. И хотя, как Вы заметили, факт того, что я работал на множестве разных real-time PCR машин, и не говорит о моей компетенции, это дает мне право на некоторый сравнительный анализ. Есть ли у Вас подобное право? Задайте себе этот вопрос, а потом подумайте, стоит ли растопыривайть пальцы на форумах. Вы высказали неверное утверждение, что для real-time PCR используются пробирки с круглыми крышками, я его опроверг, но, Вы до сих пор не можете с этим смириться. Вам нужно больше доказательств? Пожалуйста, вот manual ABI, где черным по белому говорится: Domed caps are not compatible with the 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System. http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04333458.pdf Искать такой же manual для Bio-Rad Stratagene или сами поищете? Ваш снобизм не позволяет Вам переосмыслить Ваш скудный личный опыт НЕВЕРНОГО использования круглых крышек для real-time PCR, и Вы продолжаете настаивать на том, что были правы. Так вот, практика – лучший критерий истины. Поставьте параллельно одинаковые реакции в пробирках с плоскими и круглыми крышками и сравните результаты. Если PCRs в пробирках с круглыми крышками будут выглядеть лучше, и Вы это документально подтвердите, я готов принести свои искренние извинения, а пока -

Плоские крышки, выпуклые...
Покупайте, те что ДЕШЕВЛЕ, но из тех что подходят к вашим пробиркам. Планшеты Вам обойдутся дороже пробирок так как не всякий эксперимент занимает 96 лунок. Mastermix для обычного PCR лучше Promega To go Polymerase- из зарубежных она самая дешевая и прямо после PCR можно наносить образац на форез- не надо добавлять loading buffer.

именно. На одной из научных конференций был доклад. В одной уважаемой пцр-лаборатории озадачились выбором - плоский или выпуклый. Так вот результаты исследований показали, что лучшие результаты Real-time при прочих разных условиях получаются при использовании

1) пленка
2) выпуклые крышки
3) плоские крышки

исследования проводили на разных машинах, но среди них были разные биорадовские машинки

Эта система не бидистилят делает, а деионизованную воду, "миликьюшку" (устар. народн. ) . Правда лично я у нее 18 МОм ни разу не видел, максимум до 14-14,8 дотягивала (правда у меня смола просроченная стоит). А так клевый аппарат - напрямую к водопроводу подключается. Вообщем рекомендую.

По поводу ПЦР машины - вместо MJ я бы взял старый добрый проверенный AB 2700 - летом интересовался вопросом - его предлагали за деньги в районе 150000 р. (точно не помню). Я в результате купил Био-рад с1000, но исключительно за скорость, а еслиб денег было меньше то однозначно АВ 2700 - проверенная временем машина.

в мануале AB обычно написано, что пробирки и все миксы должны быть только ABI (спаси господи) , а уж про фаст ПЦР - отдельная история .
С вам просто поделились, что нет никаких проблем с использованием стандартных ПЦР пробирок с круглыми крышками на большинстве стандартных реал-таймерах - и это правда - нет никаких проблем .

А главное, вы забыли, что речь в топике идет не о реал таймере, а об обычном ПЦРнике - так ему вообще плевать на крышку )).

Похоже, многие компании перестали продавать ПЦР пробирки с круглыми крышками - раньше мы заказывали у Sarstedt и в стрипах, и отдельные пробирки, а сейчас производство прекращено. У Инвитрогена тоже нет. Видимо, не очень они востребованы - хотя в свое время были запатентованы.

Круглые крышки пробирок не для улучшения стекания конденсата (бред!) и не для сфокусирования сигнала (это не линзы!), а всего лишь для регулирования давления прижимной крышки - упругие выпуклые крышки деформируются при закручивании крышек со всей дури, при этом пробирка не сплющивается, ну и крышка термоциклера цела остается...
Многие фирмы снимают их с производства, так как научились производить "любой пластик под любой термоциклер", т.е. совместимые.

а что, если плоская крышка, то пробирка сплющиться может? или крышка циклера сломаться? это вы про какой циклер говорите?
вообще плоская на мой взгляд удобнее, но факт остается фактом - сигнал в выпуклых и с пленкой выше, если, конечно, свято (слепо) верить научным докладам на конференциях

У меня благополучно сминается тонкостенный пластик от с выпуклой крышкой (биорад). Стрипы с плокой крышкой той же фирмы выдерживают давление.
А вообще-то у многих циклеров можно отрегулировать давление крышки и (или) промерить высоту пробирок.

у вас не стрипы выдерживают давление, а просто по стрипу давление распределяется, и на каждую "пробирку" приходится меньше усилия, вот и все. Чтоб не сминался ЛЮБОЙ пластик, поставьте по углам блока 4 пустые пробирки, и пусть себе стоят , и никаких неприятностей более не случится. Не стоит обсуждать всякую ерунду, очень похоже на Свифтовских остро- и тупоконечников

))) Если заполнены все 96 лунок, то о каких свободных углах блока можно говорить? Не надо "умничать".

а если все 96 используются, то нет такой силы, чтоб из равдавить. разве что бетонный блок с высоты бросить, но тут возникнут проблемы иного рода

Сдается мне, что Вы немножко врете - первый раз "вижу" чтоб ВСЕ 96 пробирок в стрипах сминаются
Ну и могуч этот Биорад...

Результат неправильного (методически) построения эксперимента - пластик должен быть один и тот и пробирки должны быть отлиты в "одних руках"...Тогда можно сравнивать. Для убедительности сравните между собой пробирки с плосикими крышками, но из разных источников .

Слепо-свято верить лучше собственному опыту.

В смысле? Что Вы курите?
Пластик от биорада, пробирки тонкостенные. И то не все 96 пробирок, а так, только половина.
Стрипы от биорада как-раз не мнутся.

Курю только сигары, и то по праздникам.
А стрипы с выпуклыми крышками тоже мнутся? Не знаю даже чем Вам помочь.

Я так понял, что в одной и той же машинке зарядили пробирки с разными крышками. Пробирки с выпуклыми крышками выше, поэтому они и смялись, а до плоскокрышных крышка еле дотянулась. Не удивлюсь, если пробирки одного типа стояли с одной стороны, а второго - с другой. Тогда еще и крышку амплификатора перекосило.

А по-хорошему надо еще знать в какие приборы пробирки ставили. Вообще-то с выпуклыми хоть и хороши для сигнала, но не во все приборы их можно засовывать. Например, некоторые апплайдовские как Верити - вообще не заточены под выпуклые, хотя на биорадовских со свистом работают. Но вообще это мопед не мой, это мне подсказали люди добрые ) сама тоже не знала.

И из чего Вы вдруг такую чушь поняли) Ну и фантазия у Вас, однако. Еще нафантазируйте, что низкий и высокий пластик в одну постановку "зарядили" (чтоб уж совсем оригинально было).

Чтоб не было таких "фантазий", надо ясно рассказывать, что с чем сравнивали...
Если не договариете, это не значит, что Вы очень умны.

дамы и господа, приветствую! давайте еще раз.
Есть пробирки с плоскими крышками, есть с выпуклыми. Есть с прозрачными, есть с непрозрачными. Для количественного реал-тайма на плашечных амплификаторах какие лучше использовать? Понятно что прозрачные, но плоские или выпуклые? Сам все хочу сравнить, но пока не дошли руки, может кто уже сравнивал? В соседней лабе используют выпуклые оптически прозрачные, но не могут разъяснить, почему не плоские?

Молочно белые!!!!
После них убедитесь, что плоские или выпуклые крышки - мелочи жизни. Почему все-таки выпуклые продаются - я выше писал...

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch

Thanks for sharing us.
파워볼사이트

This is a great article thanks for sharing this informative information. I will visit your blog regularly for some latest post. I will visit your blog regularly for Some latest post.
꽁머니

This is a great article thanks for sharing this informative information. I will visit your blog regularly for some latest post. I will visit your blog regularly for Some latest post.
mersin feribot

Thanks for the blog loaded with so many information. Stopping by your blog helped me to get what I was looking for.
안전놀이터

This article was written by a real thinking writer. I agree many of the with the solid points made by the writer. I’ll be back.
https://www.amazon.com.br/dp/B09M7HYL7R

Superbly written article, if only all bloggers offered the same content as you, the internet would be a far better place..
sexybaccarat

Just admiring your work and wondering how you managed this blog so well. It’s so remarkable that I can't afford to not go through this valuable information whenever I surf the internet!
Canada Visa Application

Become a fashion stylist icon! Give your clients total makeovers in this fashion dress up story game. Choose from tons of chic clothes, makeup, hairstyles, and accessories to style the perfect new look for your clients.

Show off your best fashion and makeup skills to grow your styling business and make more money and get amazing clients. Make the right fashion and makeup choices to keep your clients happy and avoid the drama of ending up on a worst-dressed list! This styling and makeup game is a fashion makeover story dream come true!


https://modapkon.com/super-stylist-fashion-makeover-mod/