Клонирование совершенно обыкновенное: вектор (режется как обычно, по двум разным сайтам), вставка (ПЦРный продукт, тоже режется для создания липких концов). Но хочется как-то разобраться в методах очистки этих фрагментов - в чём принципиальная разница и что когда лучше использовать.
Способ 1 - выделение из геля. Я делал просто вырезание куска в LM-агарозе и потом плавление/ж.азот/ЦФ. Вариации - различные киты/колонки/etc.
Способ 2 - очистка на какой-нить там смоле типа Glassmilk (Geneclean кит, например).
Может кто-нибудь эти способы прокомментировать и сравнить, что когда лучше применять?
И ещё - насколько это необходимо - чистить ПЦР-продукт перед рестрикцией? (а то это, получается, две очистки приходится делать - до и после рестрикции...)

Последнее время мы используем комбинированный способ.
Разделяем рестрицированные фрагменты в обычном агарозном геле, а дальше пускаем в дело GeneClean kit from Sigma: растворяем куски геля с ДНК, сорбируем последнюю на стеклянные гранулы и элюируем ее оттуда водой.

как то странно вы разделили эти методы? :huh:
GENECLEAN Kit тоже используется для очистки фрагментов из агарозы.
или я ошибаюсь???
:unsure:

А вам обязательно надо чистить? И если не секрет от чего?

Po opitu, odna ochistka iz gelia OBIAZATEL'NA (do ili posle restriktsii, luchshe do). V protivnom sluchaje background vishe. Edinstvennoje iskliuchenije, kotoroje prihodit v golovu produkti RT-PCR. Pri ochistke posle restriktsii malije fragmenti otrezannije ot PCR produkta sviazivajutsia s matriksom kolonki nastol'ko sil'no, chto ne eluirujutsia (pri drugih sposobah ochistki ne sviazivajutsia voobshche). V resul'tate lipkije kontsi etih malih fragmentov ne konkurirujut s PCR-produktom za ligirovanije s vektorom.

Да, конечно, Вы правы; разделил я не совсем корректно - просто хотел подчеркнуть, что можно очищать только гелем, можно только сорбцией, а можно их комбининровать.

Чистить, к сожалению, надо при клонировании. Относительно вектора - это очевидно, нужно избавиться от вырезанного кусочка, иначе он обратно залигируется. А для ПЦР-вставки, зачастую, тоже: 1) насколько я понимаю, некоторые рестриктазы, в том числе и EcoRI, плохо работают в ПЦРной смеси; 2) надо избавляться от Taq, иначе она продолжает работать и "портит" липкие концы. Кажется, так... Знатоки, поправьте - я правильно излагаю?

А что, если я делаю обе очистки (ПЦР-вставки, до и после ретрикции) не в геле, а на Glassmilk - этого недостаточно? в чём будет разница?

По моему (довольно большому ) опыту клонирования и вектор и вставку нужно чистить из геля; неважно как чистить, но лучше всего работают колонки. Вектор во-первых трудно разрезать на 100% - самая маленькая примесь оставшейся суперскрутки создаст неслабый бэкграунд. Ну и во вторых участок что вы вырезали встанет обратно...

ПЦР-вставку перед рестрикцией чистить тоже надо: хотя бы потому что полимеразы вам "зашлифуют" 5' выступающие концы а proof-reading полимеразы и 3' выступающие концы; я всегда просто переосаждаю этанолом - даже без фенол-хлороформенной экстракции этого достаточно. А после рестрикции чищу из геля. Хотя можно и наоборот: ПЦРник почистить из геля, потом рестрикция, потом фенол-хлороформ или колонки.


Удачи

Выделение из геля штука хорошая, но даже небольшие примеси агарозы очень сильно ингибируют лигирование.

to comp3v
Для смены буфера достаточно переосаждения спиртом.
Для очистки ПЦР продуктов от праймеров достаточно почистить на сефадексе, например G-50.
Избавиться от активности Taq то же можно при переосаждении.

:blink:
Оппа! Я, вообще-то, всё время считал, что добавление небольших количеств агарозы, наоборот, повышает эффективность лигирования (то ли за счёт "иммобилизации" молекул, то ли ещё что-то в том же духе). Неужели не так?

Насколько мне известно, повышает скорость лигирования PEG.
А вот агароза ингибирует. Я даже при выделении из геля использую отдельную агарозу, с которой все получается. Подобрана эмпирическим путем.

Ничего агароза не ингибирует, если лигирование обычное, а не изыск какой нибудь. Вы никогда не пробовали клонировать ПЦР-продукт прямо из агарозы? Т.е. берете носик на 200мкл, тыкаете его в свой бэнд, потом одеваете на пипетку, и выплевываете в лигазную смесь то что в него попало? В Т-вектор клонируется со свистом (до 80% эффективности).
Вообще я выделяю вставки из геля квакогеновским китом.
P.S.: GlassMilk - это не смола

Народ, я вас вот почитал, и мне любопытно: что-то никто из вас не упомянул инвитрогеновский Топо-клонинг. Почему? Не используете? Или не ндра?

Ну ладно, хотите самый простой и эффективный способ клонирования PCR-фрагментов после обработки рестриктазами? :D

Не знаю, дефосфорилирован ли Ваш вектор после обработки с двумя рестриктазами, но неважно. Допустим, дефосфорилирован.

1. Сразу после PCR, центрифугируйте продукты через Micropure-EZ Enzyme Remover (Amicon) при 5000 - 10000g - не на максим. скорости!

2. Добавьте 4 или более объемов 1х рестрикц. буфера (надеюсь, обе ваши рестриктазы работают в совместимых буферах; во всяком случае, выберите такой, где обе работают хотя бы с 75% эффективностью) и обе рестриктазы. Порежьте 1-2 часа при нужной температуре.

3. Можно пропустить опять через Micropure-EZ Enzyme Remover, хотя необязательно.

4. Поместите на лед и на льду доведите буфер примерно до 1.25х Т4 ДНК лигазного при помощи соответстующего 10х Т4 ДНК лигазного буфера. Здесь надо потрудиться немного и рассчитать - один раз, зато потом это уже рассчитывать не нужно будет.

5. Смешайте с вашей порезанной плазмидой. Добавьте 1/4 от конечного объема (рестрицированных PCR фрагментов и плазмиды в 1х T4 DNA Ligase buf.) 50% PEG 6000. Хорошо перемешать пипетированием (не вортексировать и особенно не центрифугировать!). Добавить полмикролитра T4 DNA Ligase и опять перемешать пипетированием. Все это делается на льду - чтобы рестриктазы не работали. Подождать 10-15 мин.

6. Центрифугировать при мах скорости 5 мин. Аккуратно убрать PEG-супер. Растворить в нескольких микролитрах ТЕ. Добавить 10х рестрик. буфер до однократного и одну из использованных вами ранее рестриктаз (я люблю делать это в 10 мкл, но можно и 15-20 мкл). Порезать 1 час.

7. Добавить краски и загрузить на агарозный гель. Гнать достаточно долго при достаточно высоком вольтаже (не меньше 1 часа), чтобы получить очень хорошее разрешение фрагментов. Сделать фото, не вынимая гель с прозрачного трэя, и на нем определиться (не нужно долго подвергать ДНК ультрафиолету), какая банда содержит вектор+инсерт. Вырежьте ее.

8. Поместите кусочек геля в 1х T4 DNA Ligase buf. Подержите при ЛЕГКОМ побалтывании минут 15-20 и смените буфер на свежий. Опять подержите 15-20 мин и смените буфер. Так сменить 4-5 раз.

9. Вытащите немного ДНК (а много и не нужно ) одним из следующих способов - freezing/thawing (это когда гель несколько раз замораживают -оттаивают при -70С - RT), центрифугированием при ~5000g через Эппендорф с 0.22 мкм фильтром (несколько фирм выпускают, точно не помню), или самый простой - воткните в гель 200 мкл тип с пипетманом и просто высосите несколько капель жидкости. Я часто пользуюсь именно последним способом.

10. Возьмите 2 мкл (больше не нужно!) таким образом полученной линеаризированной плазмиды с инсертом, разбавьте в 30-40-50 мкл 1х T4 DNA Ligase buffer и добавьте 1-2 мкл T4 DNA Ligase (единиц 5 по крайней мере). Лигируйте 1-2-4 часа, по настроению, и затем без никаких дополнительных манипуляций - трансфицируйте 10 мкл в любые хим. компетентные клетки (если очень хочется электропорировать, то нужно очищать ДНК от солей - НО! Результат будет ХУЖЕ).

11. Хит шок делается так: на льду смешиваете 10 мкл плазмиды и 100 мкл компетентных E. coli. Потом СРАЗУ тыкаете в 42С баню - никакой инкубации на льду не нужно, результат будет только хуже. После хит шока, как водится, добавить LB, инкубация 1 час с взбалтыванием при 30С (если инсерты нестабильны) или 37С. Размазать 20-50 мкл аликвоту на чашке. Гарантированы тысячи колоний - если не отступите от моего протокола . Потому что я не разъсняю, почему надо делать именно так. А здесь есть мно-оо-оо-ооо подводных камней, и если вы решите "улучшить" какой-нибудь этап дополнительным фенолом или этанол-преципитацией или там GeneClean - то работать уже не будет .

Секреты фирмы, так сказать.

Izbavliat'sia ot kusochka? Zachem? Provodite restrikciu vmeste s fosfatazoi, a potom libo prozar'te, libo na kolonku

Вот это уже похоже на алхимию

3. Можно пропустить опять через Micropure-EZ Enzyme Remover, хотя необязательно.
5. ........ Все это делается на льду - чтобы рестриктазы не работали. Подождать 10-15 мин.
Если необязательно, тогда понятно.

"Добавить полмикролитра T4 DNA Ligase и .............."
Я обычно считал по единицам, а не по мкл У разных поставщиков разная активность.

пункт 5 и 6 не соввсем понял, что? лигаза будет шить и одновременно ДНКа будет преципитировать? :huh:
Пункт 7: Интересно как Вы отличите кольцевую плазмиду со вставкой от линейки, которая незалигировалась?
Пункт 8: Зачем?

Трансформацию по-Вашему попробую... Интересно однако

А не надо пробовать только трансфекцию. Это как раз малозначительный шаг.

Ах да, совсем забыл - в п. 10, после лигирования и перед трансфекцией, надо добавить протеиназу К (20 мин при 37С или 50С, неважно), чтобы убить лигазу. Потом уже - вместе с протеиназой! - смешивать с химически компетентными клетками и делать хит шок. Безо всяких преципитаций.

"Что именно понятно?" - Понятно, что если не пропускать через ремувер, то рестриктазы останутся. Если пропустить, то что там будет работать кроме лигазы?
"Вы что, никогда не слышали про лигирование в присутствии 10-15% PEG 6000"
Слышал, и не поверите, даже сам делал, только у меня было 2,5% ПЭГа
Пункт 6, извините, как-то упустил... Тогда дальше все понятно.
Единственное, мне кажется необязательно вымачивать в лигазном буфере в п.8, поскольку дальше идет разбавление ТАЕ в 15-25 раз, умноженное на разведение в лигазной смеси.

А вообще, конечно, нагромождение какое-то К чему тысячи клонов? Обычные ПЦР-продукты клонируются на раз (ну илипочти на раз, в зависимости от вектора) по липким концам с примерно 90-100% эффективностью обычной лигазой. При этом после второй рестрикции (если рестриктазы не подходят) ДНКу (вектор и вставку) я чищу форезом, и просто лигирую. Проблем как-то не было...

Ну дак - не нравится, не ешьте. Проблема ведь была не у Вас. А предложенный метод работает с PCR фрагментами любой длины - хоть 15 кб, если удастся такой получить.

Ну конечно такой сработает Я ж имел в виду обычное клонирование, без изысков. А 15кб - легко, если матрица по ГЦ не сильно зашкаливает

Кстати о птичках, на ваши вопросы я напрямую так и не ответил.



Не нужно чистить PCR продукт перед рестрикцией. Только нужно избавиться от полимеразы - лучше всего при помощи Micropure-EZ Enzyme Remover (Amicon) или такой синенькой резины от Clontech, название по смыслу тоже похоже на Enzyme/Protein Remover, давно не пользовался, потому что перешел на Enzyme Remover (удобнее).

to RYM.
Какую продолжительность теплововго шока (42) при трансформации Вы рекомендуете использовать?

Вообще-то, это зависит от штамма E. coli. Есть штаммы, где 42С нельзя, надо меньше (37С 5'). Желательно посмотреть, что компания-производитель штамма рекомендует, предположительно они оптимизировали. Если денег жалко покупать у них компет. клетки, есть свои приготовленные, можно им просто позвонить в техсуппорт, они всегда подскажут (если им сказать, что потерял бумажку-вкладыш с инструкциями).

Я обычно использовал 45 сек. Но можно и 25, и 60, и 90. Если клетки домашнего приготовления, то имеет смысл оптимизировать самому один раз хотя бы. Потому что повторяющиеся из протокола в протокол "стандартные" условия очень часто в корне неправильные, мягко говоря, не оптимальны.

Например, безумное количество людей продолжает преципитировать ДНК в этаноле при -20С и даже при -70С! Потому что кто-то в самом начале, лет 30 назад, так написал в своем протоколе, и это попало в Маниатис. А надо преципитировать при комнатной температуре, причем вортексируя, а не давать ДНК в растворе лежать спокойно. Достаточно 2-3 мин вортексирования при RT, и 10 мин ц/ф при RT же, чтобы получить >99% ДНК даже очень малой концентрации в осадке. Потерь НЕТ как класса. Но при -20С и особенно при -70 будут большие потери ДНК, если только ее концентрация не была огромной.

Предыдущее сообщение было мое, я, оказывается, зашел без ника.

а я вообще для своих диких колей делаю шок 54 градуса... почти в два раза эффективней получается.

RYM,

Чтой-то много этапов получается у Вас для простого лигирования PCR-фрагмента в вектор. Много чести. Я делаю проще:

PCR реакционная смесь экстрагируется равным объёмом хлороформа. Это убивает полимеразы. Затем верхняя фаза наносится на гель, вырезается нужный по мол. массе фрагмент.

Этот фрагмент выделяется при помощи Qiagen kit и рестриктируется в том буфере, где наждая из рестриктаз активна хотя бы на 25%. Далее 75-80 С 20 минут для убиения рестриктаз и снова выделение на Qiagen cartridge, без нанесения на гель.

Далее фрагмент лигируется в плазмиду, выделенную из геля при помоши того же Qiagen - 1.5 часа при 16 С или 4-5 часов Room Temp. Затем электропорация 1-1.5 микролитров и рассадка половины смеси на чашку. Утром вырастают колонии, 2-6 минипрепов, и более чем один клон содержит вставку.

А можно разъяснить поподробнее - за счёт чего будут такие потери?

присоединяюсь.... так как гость кажется не понимает что говорит....

гость:
преципитация это достаточно тривиальная "вешь", а вот выбор как ее проводить, зависит как раз из той самой концентрации материи (ну и безусловно возможных "продуктов" которые будут соосождаться во время оной, и после их расстворения возможно будут накладывать дополнительный "геморой"...), которую Вы хотите прецепитировать....

Раз уж пошла такая фишка про "зарю молбиологии" то именно на ее заре было опубликовано несколько статей по преципитации ДНК. ДНК радиометили, осаждали и меряли выход. Потери ДНК на -20 и -70 действительно наблюдали (надо сказать небольшие) и связывали их главным образом со значительным увеличением вязкости спирто-водного раствора при этих температурах и соответственно при центрифугировании ДНК оседает хуже. Время преципитации влияет на выход очень незначительно. Главный фактор - центрифугирование, именно длительные центрифугирования позволяют улучшить выход при исходных малых конц-ях ДНК.

Поэтому при средних начальных концентрациях/количествах ДНК (скажем, больше 50 ng/ul) оптимальный протокол примерно такой:

- инкубируем на льду не более 5 минут; можно вообще не инкубировать, а хорошенько провортексить при комн. темп. (правда этанол лучше чтобы был холодный - из морозилки или со льда)
- крутим не менее 15 минут на -4'C, по этим статьям насколько я помню там выход достигал максимума после открутки минут 40
- если ДНК очень мало, то на -70 или на лед на ночь и потом крутим более часа на -4'C (примечательно что -20 работает хуже льда и хуже -70)

[quote=AVP,26/03/2005 - 03:23]
присоединяюсь.... так как гость кажется не понимает что говорит....

Я написал уже, что обсуждаемое сообщение было мое, я просто вошел тогда без ника.

Так вот, AVP, я-то как раз понимаю, что говорю, - а Вы? Тривиальная, говорите, вещь преципитация? Ну-ну, интересно, как Вы ее представляете? Я вот в свое время не поленился, когда работал над своим патентом в области повышения эффективности клонирования, ознакомиться практически со всей литературой по вопросу о преципитации ДНК в растворах этанола, мультивалентных катионов, PEG, и пр. (я также прочел ВСЕ по методам клонирования, что было опубликовано на момент подачи патента). Простоты что-то я там не припомню. Известно ли Вам, допустим, при каких концентрациях ДНК образует торообразные структуры или "палочки" (rods)? Как на это влияют мультивалентные катионы и PEG? Каков диаметр этих торов и какое отношение это имеет к максимальной длине фрагментов ДНК, которые могут укладываться в торы? Каков механизм т.н. "macromolecular crowding"? Подсказка: в молбиол. журналах Вы про это ничего не прочитаете. Этими исследованиями занимаются биофизики - и публикуются, соответственно, в биофизических журналах. Которые почти никто из молбиологов не читает и потому ничего не знают про молекулярные механизмы этих "тривиальных" процессов.

comp3v

При очень высокой концентрации ДНК (ЕМНИП, порядка 10 мкг на мл или чуть меньше), молекул ДНК так много, что они постоянно касаются друг друга и образуют как бы бесформенную "паутину", которая быстро "коллапсирует". Потери будут малыми даже при -20С, -70С.

Совсем другое дело, если концентрация ДНК мала - меньше 1 мкг/мл. Тогда преципитация заключается именно в образовании торов и палочек. Молекулы ДНК должны встретиться друг с другом за счет диффузии (или вортексирования!) и их должно быть достаточно много в одном торе/палочке (несколько десятков, для 1 кб ДНК), чтобы он мог опуститься на дно пробирки при центрифугировании. Чем ниже температура преципитации, тем меньше скорость диффузии, и тем больше времени требуется ДНК, чтобы образовать торы и палочки. Потому при -20С и особенно -70С потери ДНК будут значительно больше. Об этом было даже написано в одном из молбиол. журналов лет 15 назад (NAR? не помню... у меня где-то есть копия той статьи, но искать долго), хотя это хорошо известный и именно что "тривиальный" факт в биофизических журналах. Кроме того, при -20С и -70С в осадок выпадут всякие соли, полисахариды и прочая грязь, что вам совсем не нужно.

Так вот, я преципитирую не более 5 мин при RT - с интенсивным вортексированием от 1 до 3 мин., а затем сразу центрифугирую при RT от 5 до 10 мин . Потери у меня практически нулевые - что легко проверить с меченой ДНК. Потому что я как раз ПОНИМАЮ, что за процессы происходят в пробирке.

Уважаемый гость, все с точностью до наоборот. Либо статьи те - дурные, а руки у авторов были кривые, либо речь идет вообще не о тех протоколах преципитации ДНК, что применяются сейчас. Сначала применяли безумные концентрации NaCl, например (типа 1 М), и меньше этанола (2V, кажется). И вообще, "малыми" концентрациями ДНК в то время считались совсем не те, что сейчас - тогда работали с очень большими концентрациями, как раз типа 10 мкг/мл. Все это вообще не применимо к действительно малым концентрациям ДНК, о которых говорю я - напр., 1-10 нг/мл. А то, что Вы называете средними начальными концентрациями ДНК - больше 50 ng/ul, то есть больше 50 мкг/мл, вообще ни в какие ворота не лезет.

Если вы правильно преципитируете, то время центрифугирования не имеет большого значения, а время преципитации - и температура! - имеют как раз очень большое значение. Почему - насчет преципитации я написал выше. А если торы и палочки у вас уже сформировались, во время преципитации, то они осядут на дно даже за 5 мин ц/ф, 30 мин ц/ф тогда не нужно. Другое дело, если вы преципитировали при слишком низкой температуре (-70С, для примера), тогда полноценные торы у вас не сформировались, только недомерки. Вот тогда время центрифугирования может увеличить выход ДНК - потому что недомерки опускаются на дно очень медленно.

RYM: а Вы много тех самых преципитаций то провели???? Я не знаю какие журналы Вы читаете и какие патенты читали... если Вы думаете, что коллеги работаюшие, например, с 32P которой метят субстратную ДНК или РНК устраивают маленький "Чернобыль" в отдельно взятой пробирке (хотя мне и это приходилось видеть) - это Ваше право...
И пожалуйста, не недо ля-ля два рубля на счет всех Биологов и Мол. Биологов тоже, которые не читают Биофизическую литературу или какую другую... не судите по себе или тем местам где Вам приходилось бывать, please (nothing personal)...
И еше раз скажу... преципитация, как метод, тривиальна.... а выбор условий как раз и зависит от....

и наверное последнее... если Вам есть чем поделится с коллегами, то на этом сайте есть раздел Методы куда можно сложить свои наблюдения и знания... безусловно если Вам это нужно, т.е. если Вы этого хотите...

AVP,27/03/2005 - 00:43

RYM: а Вы много тех самых преципитаций то провели????

Да как-то не приходилось подсчитывать. Наверно, за десять тысяч точно перевалило. А Вам не кажется довольно глупым такой вопрос? Я это знаю не теоретически, будьте уверены.

Я не знаю какие журналы Вы читаете и какие патенты читали...

Разные, очень разные. Не только молбиологические, в отличие от других молбиологов. Потому что, хотя я и не биофизик, но физика с математикой меня не пугают - я по первому своему образованию физик (ускорители и т.п.), и только по второму образованию - молбиолог.

если Вы думаете, что коллеги работаюшие, например, с 32P которой метят субстратную ДНК или РНК устраивают маленький "Чернобыль" в отдельно взятой пробирке (хотя мне и это приходилось видеть) - это Ваше право...

Нет, я не про грубые ошибки. Скорее, про узость мышления и про разобщенность научного знания - например, факты, давно известные биофизикам, полностью остаются вне поля зрения молбиологов. И что читают мои коллеги молбиологи, я прекрасно знаю. Потому что вижу сам, раз, и приходится обучать и переучивать, два. ЛОЖНОГО знания у них очень даже хватает. Взятого из разных мэнуалов типа Маниатиса и Current Protocols.

И пожалуйста, не недо ля-ля два рубля на счет всех Биологов и Мол. Биологов тоже, которые не читают Биофизическую литературу или какую другую... не судите по себе или тем местам где Вам приходилось бывать, please (nothing personal)...

А разве читают? Вот Вы, без обид, и nothing personal, читаете? Я удивлюсь, и не надо принимать это за высокомерие. Если честно, Вы читали про те же торы, образуемые ДНК при преципитации, до того, как я про это написал здесь? Вот почему-то ни в одной молбиол. статье или в мэнуале я не встречал упоминания об этом. Потому что то самое разделение Знания на разные комнатки зашло уже весьма далеко.

И еше раз скажу... преципитация, как метод, тривиальна.... а выбор условий как раз и зависит от....

Как метод? Что Вы под этим понимаете? Просто вопрос терминологии. Если Вы имеете в виду происходящие процессы, то позвольте с Вами не согласиться. Если же простоту написания этой процедуры в протоколе, то да, куда уж проще - одна-две строчки. И позвольте еще раз, без личных намеков, упомянуть, из своего личного опыта, что я еще не встречал МОЛБИОЛОГА, который действительно представлял бы, что при этом происходит на молекулярном уровне, то есть понимал бы, что именно происходит с ДНК, когда он меняет условия. Я, кстати, не считаю мои представления об этом такой уж моей собственной заслугой - большинство сделано не мной, я прочел это в соответствующих статьях, я "лишь" осмыслил и применил на практике - но другие-то даже не прочли!

и наверное последнее... если Вам есть чем поделится с коллегами, то на этом сайте есть раздел Методы куда можно сложить свои наблюдения и знания... безусловно если Вам это нужно, т.е. если Вы этого хотите...

Если я это и сделаю, то очень выборочно. Не потому, что я такой плохой, а потому, что мои "методы" представляют слишком большую ценность и являются ноу-хау. Не все можно или имеет смысл патентовать, что-то держится как trade secrets или know how. Но, без хвастовства, то, что я могу делать с ДНК, не может никто в мире.

Граждане, ну что ж вы даже такую дискуссию в наезды превращаете?!!!
2 AVP: не стоит так заводиться; мне, например, весьма интересно читать, то что тут понаписали (спасибо всем!) - ни на что, правда, не ссылаются, к сожалению, но всё же... Фразы типа "то, что я могу делать с ДНК, не может никто в мире" - это, конечно, тоже перегиб, но и к этому можно быть снисходительным. Так что давайте продолжать по теме, а не уклоняться в фаллометрию . 2 RYM: а Вы ещё ссылочки, ссылочки давайте - и будет совсем супер!

RYM: пожалуйста не думайте что я пытаюсь на кого то наехать.... и в мыслях нет...
Я с Вами полностью согласен в том, что некоторые ограничиваются протокольными знаниями и дальше чем к 1 мкл add 2 мкл не идут... впрочем не всегда это и на практике нужно знать, что же такое происходит, когда к 1+2...
правда, переодически видишь и слышишь, что ну как же так, я все делал так как написано к 1+2, но вот что самое удивительное, в итоге получил 0... причем ведь зачастую получается, что если собрать вместе все знания которые были получены даже в "школе" и то можно уже представлять что, зачем и почему?
Как говорили нам на вводной лекции после поступления в Универ, "мы постараемся влить в Вас основные академические знания и научить Вас пользоваться справочной и другой литературой, а все что Вам нужно будет знать в дальнейшей Вашей деятельности, Вы узнаете сами по мере необходимости... "
как переодически говорят (и здесь тоже): "Говорила мама учи уроки, спрашивать будут...", так переодически всплывают такие мысли, покрайней мере у меня... и приходится поднимать литературу о которой в мыслях раньше даже намеков не было...
И ведь что самое удивительное, что это относится ко всем, физикам, биологам, химикам и т.д., которые пользуются "смежными" методами или рассматривают процессы, которые вроде бы как, в прямую данная специальность или специализация и не изучает ...

да какие к лешему наезды.... :D могет быть у меня стиль обшения такой... да и иногда хочется подержать человека за мягкие места.... он тогда более разговорчивым становится... (sorry RYM, nothing personal)....
ссылки говорите?... млин это еше одна больня тема, проблема и т.д., покрайней мере для меня... как более менее упорядочить то что видел, слышал, куда то записал, но об этом забыл уже 25 раз, али распечатал, оно ну очень сейчас нуно, но вот лежит себе где то между столами и не видимо для восприятия....

Хочу Вам только пожелать быстрейшего патентования или опубликования Вашего ноу-хау, да и методов которыми Вы владеете...
может быть знания, которыми владеете Вы так не обходимы, например, мне сейчас, хотя может быть даже и не в том виде как Вы это представляете для себя... так как новые знания, они всегда НОВЫЕ... и от того что они пролежат еше 1-10 лет на столе, они более новыми вряд ли будут...

У меня был репринт статьи то ли из NAR, то ли еще откуда 198какого-то года, где были подробные экмперименты и графики по осаждению ДНК спиртом в разных условиях. там как раз очень впечатляющей была разница комнатной при температуре и 20 градусах мороза. правда, по-моему там указывалось что если меньше 10 мкг/мл, потери везде большие. но мне никто не верил, и в конце концов общественное мнение победило. теперь каждый раз, запихивая пробирку в морозильник, вспоминаю эти графики и думаю: а может и не было никакой статьи...может это шутка была... чего ж до сих пор никто так не делает... и тд

Вообще-то когда один чешский врач в позапрошлом веке предложил коллегам мыть руки, перед тем как принимать роды, его вообще из врачей выгнали и умер он где-то на помойке.

Между прочим, RYM, а какая минимальная концентрация ДНК? А соль надо добавлять? А спирта сколько? Если это ноу-хау, я никому не скажу, чессслово. Все равно никто не поверит.

Я бы рад, да вот после землетрясения (то есть двух переездов) у меня с бумагами до сих пор полный бардак. Сейчас глянул - среди разобранных папок с бумагами этой папки нет, быстро найти ее нереально .

Единственно, что могу посоветовать для сравнительно быстрого поиска таких статей - сделайте поиск в Medline с комбинациями ключевых слов вроде

DNA precipitation ethanol polyethylene glycol PEG toroid rods polyvalent cations spermine spermidine

Это даст первоначальную зацепку, а по ссылкам из Введения первых можно найти ключевые статьи в этой области.

По моим наблюдениям, у большинства молбиологов отношение к методам примерно такое же, как к любой сложной технике. Зачем знать все детали, как работает комп или телевизор, если пользоваться ими можно и без детального знания? Молбиологи делают фундаментальную науку - они открывают и изучают новые гены и белки, это важно и интересно. А методы, если они общепринятые и вроде бы работают, это просто tools, вроде компьютера или телевизора. Работают - и хорошо, что еще нужно? Если это не сломалось, не надо это чинить, то есть не надо отступать от работающего протокола.

Понимаете, в чем дело. Как ни дико это звучит, и как ни трудно в это поверить, БОЛЬШИНСТВО стандартных методов работы с ДНК или далеки от оптимальных, или вообще действуют на ДНК крайне плохо. Молбиологи просто ПОРТЯТ или теряют свою ДНК, используя совершенно стандартные, всеми употребляемые протоколы. При этом, довольно многое об этих негативных процессах уже было опубликовано ранее - как правило, в малочитаемых журналах или малоизвестными, "неавторитетными" людьми. Эта информация разрознена и, насколько я могу судить, никто из авторов этих статей не увидел всей картины и не осознал, насколько неверно в принципе молбиологи работают с ДНК. Все шагают не в ногу...

Знаете, ноу-хау на то и ноу-хау, что его не публикуют . Это практически синоним trade secrets. Здесь речь идет не об академической науке, а о биотех. индастри. Эти ноу-хау дают очень большое преимущество той компании, что ими владеет.

Спасибо RYM!
Точно, там так и было про микрограммы... теперь вспомнила.
и говорите еще есть такие ляпы? а если не лень, какие?

RYM: на досуге почитайте информацию от Novagene....
http://www.emdbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB146.pdf

это я к тому, что как бы не получилось как в той поговорке: "первые в Мире вторые в Сибири..." можно конечно же считать, что-то своим собственным "приоритетом" и думать что для какой то "потенциальной" компании это может быть и "гипотетически" большим преимушеством... но дело в том, что "народ роеет землю носом" достаточно давно и в одчень даже различных направлениях (отследить которые не так и просто, так как информация с одной стороны может быть закрытая, а с другой стороны, она может и лежит на видном месте - да вот только не все туда заглядывают, да и читать нужно тоже внимательно...
Ек Вы о молбиологах и сложной технике то.... как говорили в одной деревеньке: "...глаза боятся, руки делают.... и люди делали до Вас, люди будут делать и после Вас..."
Ну о том, у кого и откуда торчат руки говорить как то не очень хочется, так как это вопрос одчень "научный", но отнюдь не касается только отдельно стояших, как Вы говорите мол. биологов... .
еше интересно узнать Ваше мнение... почему коллеги иногда добавляют не 2.5V этанола или 0.7V изопропанола, а немного большие их количества, им что делать больше нечего?
ну и еше, почему Вы пишете что время центрифугирования для Вас не сушественно и как то опускаете количество g (Вы же все таки физик, странно все это как то)....
Ну а о палочках и колбачках кажется мне доводилось видеть информацию, то ли в каком то патенте, то ли в одной из статей, когда перед собой любимым встал вопрос: " а нафига мне такое количество материи меченной, которую я, ну даже если очень захочу, убить до конца не смогу... "
потери Вы говорите, да они конечно есть... но то что остается не в растворе, меня устраивает...

так кто же Вам запрешает, всех мол. биологов построить в стройные ряды.... и так, ать два правой, ать два левой.... (сами же пишете, о каких то приоритетах и ноу-хау)...
и уж совсем не в тему, но вот как то строем ходить, я еше с глубокого младенчества не любил....