Комментарии к постоянной странице сайта: Выделение pDNA (минипреп - лизис щелочью)

Выделение плазмидной DNA (минипреп - лизис щелочью). Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества: очень низкая цена, высокая скорость (сравнима только с Qiaprep spin). Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9.

У меня вопрос, будет ли данный BAC пригоден для субклонирования?

Объясните, пожалуйста, в каких случаях ДНК лучше растворять в воде, а к каких - в ТЕ?

Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд.

скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?

---скажите, пожалуйста, при каком g или rpm центрифугировать?

Какой материал или на какой стадии выделения плазмиды, уточните.

вообще, старайтесь избегать использования ЕДТА, т.е. вместо ТЕ используйте просто 5-10 мМ Трис, и никакой воды. Трис нейтрального рН предотвратит гидролиз ЛНК, и ничему не помешает. А ЕДТА- это пережиток старых времен, когда Mg очень боялись, сейчас вроде методы поячище стали (а вот руки 0 нет, да...)

меня интересует какое g или rpm на всех стадиях, в приведенной методике ни для одной стадии это не указано.

все просто, если подумать головой, при этом интервалы g сильно варьируют без видимых различий в результате. Так вот- клетки- чтобы не полопались, надо крутить не более 3-5 тыс об., осветление лизата- макс, тут ничего не испортишь, равно как и все последующие стадии- 10-12 тыс. Меньше- ДНК садится хуже, что очевидно. Избегаите охлаждения- на выход ДНК не влияет, а вот соли попадают лишние

спасибо! постараюсь подумать головой:)

Скажите, пожалуйста, для чего добавляется AcONH4.

что такое ТЕ?

вот AcONH4 не надо, следы аммония ингибируют например, лигазу. воспользуйтесь ацетатом калия. Вообще, это соли, которые спрособствуют высаживанию ДНК из спиртовых растворов. А ТЕ- ну, почитайте в конце концов

Скажите, пожалуйста, у меня плазмида pCMV-Tag2 для экпрессии белка. После стадии 14 (после центрифугирования с изопропанолом) образуется осадок, который в дальнейшем не растворяется в воде.

е-мое, что за степ 14 и сколько их всего? Конкретно Вашей методы не видел, но они все об одном, различия в деталях. Осадок не растворяется по тому, скорее всего, сто это и не может раствориться- дебрис небось прихватили после осветления раствора после добавления ацетатного буфера. Не растраивайтесь, ДНК-то растворилась, посмотрите на форезеб а нерастворимое дерьмо выкиньте в педальное велдро

большое спасибо! вроде разобрался.

если дальше будут вопросы- пишите в личку или майл, так проще

Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд

чтоб лизоцим поскорее сдох?-тогда зачем егл вллбще добавлять?

все что надо он лизирует за несколько секунд. это же минипреп. а если не добавлять, то клетки не полопаются при кипячении, если передержать, то геномная днк тоже выделится.
главное, плазмида, так выделенная, всегда ярко светится на форезе. надо будет методику выложить

Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли...

мне больше нравится выделять квайджиновским китом
хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было

еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед

А скажите, у вас хорошо хранится ДНК, выделенная китами? У меня почему-то хранится значительно хуже, чем выделенная ручками с солями; через полгода-год многие препараты, выделенные китами, выглядят развалившимися на форезе, или после рестрикции выглядят как сплошной шмер.
Как у вас с этим?

А зачем pDNA лигазить или киназить?

Да и вообще лигазу он похоже не ингибирует, USB, например, пишут:
Inhibitors: Na (>0.2M), K (>0.2M)

У Эппендорфа и Сигмы так вообще есть пятиминутные киты. Прогресс идёт.

что пишет USB, я не знаю, кладу только те ионы, которые встретятся потом в буферах для всяких реакций- логично? Тем более, что трезультат будет тем же.
А что до хранения- не замечал, чаще всего плазмида идет на сиквенс, два дня, а дальше может, и не надо будет. Словом, тут ничего сказать не могу, но жалоб пока не было (от вторичных пользователей моих плазмид, к примеру)

я сначала тоже так думала, а потом мне кто-то сказал, что минипрепом оно столько не выделяется

дайте денег! дайте мне много денег!

на самом деле денег не надо (то есть, конечно , всегда надо, но обсуждается не это) для успешного выделения плазмид, все отлично делается вручную, за копейки, и по времени не сильно отличается. Единственно, что если у Вас большой поток, то киты спасают, а если штуки до 20 примерно, то глобальной разницы нет. Да, и учтите, что вручную всегда больше выход ДНК

Интересно, а что такое нужно в 3-й раствор добавить, чтобы осадок после нейтрализации/ЦФ всегда был маленьким компактным как в QIAprep Miniprep? Это из-за хаотропной соли?

P. S.
В итоге пришёл к выводу, что нужно просто посильнее/посмелее трясти при перемешивании и перед ЦФ. =)

3-й раствор- это всегда либо ацетат (калия), либо гуанидин изотиоцианат сам по себе (редко) или в смеси с тем же ацетатом. В ручном выделении- просто ацетат, так что добавление хаотропов как раз и дает более компактный осадок

Скажите пожалуйста, а что если я делал по такому же принципу, без колонок, но раньше не проделывал дважды пункты с КАс и изопропанолом? От этого что-либо меняется? Изменяться ли результаты последующего за этим фореза, имею виду неточности??? Особенно, если я потом буду резать данную плазмиду и пускать на ПЦР???

Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16:
« 1. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20'';
2. NT, 5'; »
«Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется.»

Убрать образцы на -20 и продолжить выделение на следующий день. :confused:

А то я сначала сделал, потом подумал. :shuffle: :teapot:

При желании и на этом этапе можно прерваться, т. е. бросить эппендорф с осадком, например, на - 70.

Как-то раз так делал, когда рабочий день на кафедре неожиданно закончился , никаких отрицательных последствий не заметил.

Кстати, у кого какой опыт по поводу пользы дополнительной стадии ресуспендирования в р-ре I и осаждения (перед п. 5)?

В Маниатисе в принципе рекомендуют


но сравнивать как-то лень всегда было, то делал, то нет, по настроению. На практикуме такую стадию вроде делали.

Раствор 1 - просто трата времени, даже для максипрепа. Виход плазмиды тот же , а качество не обижает!

А так ли обязательны пп.17-22 для препаратов на форез ? У Маниатиса их вроде не было.
Как я понял, их основной смысл - очистка от RNA. Может ли наличие RNA существенно ускорять полоску в геле (в 3-4 раза)?

Когда мы пробовали с ними, под конец этой многократной очистки ИПСом осадка уже не было видно. Или так и должно быть?
И, кроме того, в конце предлагается растворять в 25мкл буфера, но это сильно мало для последующей очистки фенолом-хлороформом (трудно отсасывать такие мелкие количества верхней фазы).
Или после такой очистки можно сразу добавлять буфер для внесения - и в лунки?

Вот только ща прочитал все. Какой-то мудреный метод, а потерь при нескольких переосаждениях будет много.
Если выделять не китом (Кваген мидипреп пользую), то:
1. в раствор I сразу налить РНКазу (собсна Квагеновцы так и делают)
2. после инкубации в р-ре III (NaAc или NH4Ac) и открутки, супер надо отфенолить и отхлороформить (там же белков как грязи! потом после изопропанола хрен чего растворишь), и только потом осаждать.
3. после растворения осадка дополнительные очистки - по вкусу.

2 гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf: Ну да, для минипрепа вместо раствора 1 пользую воду. Для миди - не пробовал.

Обязательно? Какую? Сколько? Этого достаточно, чтобы убрать всё, что помешает форезу?

РНКазу-А. Сколько - поц-кажу завтра (ща под рукой нет протокола). Да, уберет все.

открою Вам глаза на мир, хоть и лень писать, общее же место. Не знаю, какую идиотическию процедуру Вы там обсуждаете, похоже на бред. Выделять минипреп надо так- все в ультимативной форме, ибо практика- критерий истины, а то, что подставляюсь под всякие там "критические" замечания- по хренам. Имеющий уши...
Итак, записывайте:
1) крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс, 60-75 сек
2) ресуспендируем в растворе 1 (300-400 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы на 10-12 мл по фиг чего, допустим, 20 мМ Трис или РВS)- 250 мкл
3) добавляем 250 мкл раствора 2 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли
4) 350 мкл 3 М КAc рН 4.8-5.2 (3М по К, 5 М по ацетату- по Маниатису). Интенсивно перемешиваем переворачиванием пробирки (не вортекс!) до образования творожистой взвеси. раствор уже не вязкий.
5) крутим 10 мин на макс
6) переносим все 850 мкл в 700 мкл изопропа, перемешиваем на вортексе хорошенько
7) 10 мин на макс
8) Имеем компактный осадок, размер которого зависит от: а) от копийности плазмиды, б) от наличия или отсутствия РНК. Изопроп удаляем, остаточное его количество коротко сбрасываем на минифуге и до-отбираем досуха
9) Промываем (здесь аккуратнее- изопропные осадки можгут отделяться от стенки) 80% этанолом, произвольное количество, спирт удаляем, остатки его- также на минифуге и до-отбираем досуха
10) СУШИМ 5 МИН НА 42-44 оС
11) растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0. Все
Количество для нормальных плазмид типа pBlueScript или pGEM- 200-500 нг/мкл и выше, для менее копийных типа pQE или pET -от 50 нг/мкл и выше
Качество- аналитическая рестрикция и сиквенс- ОК, для количественной рестрикции , трансфекции- надо фенолить
На форезе- иногда много суперкойла, иногда в основном релакс, что ни хорошо и ни плохо. При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
Вот и все. Проще метода не бывает, воспроизводимость -100%, количества достаточные, траха- мин

Но ничего нового и принципиального... Но я все равно благодарю за то, что не поленились и высказались (эмоционально!). В любом случае полезно, не только для начинающих.

5мин многовато. Достаточно 2-х мин. Вообще клетки лизируются моментально, главное аккуратно перемешивать
Все равно, после отбора супера (после высаливания, перед осаждением изо-, хотя я всегда осаждал этанолом) я б отфенолил/отхлороформил, тогда ничего греть не придется (кстати, однажды открутил чачу, которая не растворилась даже при кипячении, а при следующей открутке, супер на форез -> шмер).
В остальном - это ж классика, когда нет кита под рукой.

Да, до работы сегодня так и не добрался. Но что-то у меня в голове крутиццо - стоковый раствор РНКазы 10мг/мл, конечная концентрация 10мкг/мл. Возможно вру, как буду в лабе посмотрю.
Кстати, если растворяете сухую РНКазу, добавьте к ней немного EDTA (этак 10мМ чтоб было) и прогрейте этак на 80оС минут 10-15. Она всегда загрязнена ДНКазой.
Странно, но РНКаза вроде не боится кипячения, но почему-то однажды я вскипятил ее, и она сдохла...

все так, разумеется, классика, однако 40 с лишним постов мусолят эти вот общие места. Что до фенола/хлороформа перед высаживанием изопропом, никогда не делаю, все растворяется нацело, если, конечно, в изопроп не попал ацететный дебрис. А про 5 мин в щелочи- можно и меньше, я в это время курю, точный хронометраж не веду

>крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс
А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает.
А если на 12 тыс. 2' можно?

>добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS)
Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ?

>КAc
А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету...

>на макс
В смысле на максимуме оборотов?

>При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить
А без РНКазы точно никак для фореза?

>растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0
А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает?

>во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое
Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[

>12 тыс нельзя, клетки полопаются.
Но их же всё равно потом лизировать?

>А если не фенолить
Для неколичественного фореза необязательно?