для такого фореза, котрый Вы продемонстрировали во втором Вашем топике, можно все что угодно- все равно ничего не выйдет- в том бреде, кторый Вы написали, неправильно буквально все, начиная от СТАРОГО!!!!!!!!!! TBE и кончая неправильным режимом электрофореза. О качестве презентации результата и не говорю. Хотя...Я понимаю, чем богаты, тем и рады. Как это все назавается, я упомянул парой строчек выше

>только Вы сначала СЛИВАЕТЕ СУПЕР, вместе с содержимым полопавшихся клеток. Включите мозги.
ОК. Будем исправлять и пробовать.

сказите позалуйста, поцему ДНК пБлуесцрипт II К(+) после рестрикции, на електрефорезе имеет три стриха на снимке.

да хоть 5, не имеет значения. Да и не только BlueScript- у Вас имеются различные формы плазмиды: суперкойл, куча разных релаксов, у всех у них разная подвижность из-за разной способности этидия интеркалировать в разные спирализованные формы. /расслабьтесь, у ВАс все нормально

После рестрикции плазмиды 3 или 5 полос и расслабься Я бы не расслаблялся...

сорри, не заметил фразу про рестрикцию. Тады ой! Стало быть, сайтов у Вас много больше, чем должно быть. Или, что вероятнее, идет недорестрикт (детали неизвестны, сколько рестриктаз было в рестрикции)- надо дополнительно чистить плазмиду или же сменить фермент

болшое спасибо вам за ответ:)

У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?

--У кого-нибудь было такое,что после инкубации с RNA-зой рDNA деградировала? Если добавлять RNA-зу в GTE, то сколько?

RNA-зу, прокипятите в кипяще бане минут 20 преред использованием. Вся ДНКаза, и загнется.

Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

--Скажите, пожалуйста, как можно избавиться от пятна РНК в плазмидной ДНК , выделенной вручную? я хочу ее далее секвенировать.

А она по идее сильно мешать недолжна.
А так обработать РНКазой только без фанатизма достаточно 10-30мкг/мл, а потом фенолить, но от фенол надо хорошо избавится переосаждением спиртом и спирт-эфиром.

Можно еще осадить РНКу 6М LiCl. Но это малоэфективно.

В более продвинутых протоколах (китах) РНК-аза используется до начала лизиса клеток. Так что возвращайтесь на исходные позиции, а готовую плазмиду освобождать от РНК-аз - дороже обойдется. Если это пятно не такое яркое, не обращайте внимание и секвенируйте - авось обойдется.

добавляю РНКазу между 1 и 2 растворами, держу 15 минут на 37С. Все работает

1) Кто нибудь пробовал эту методу для выделения плазмидного профиля из диких штамов? Если есть опыт, поделитесь! Необходимость только в форезе.
2) Теоретический. Откуда такая разница в концентрации плазмид, когда вместо LB используется МПА?

Товарищи!
Кто может подсказать почему TE буфер при выделении плазмиды мелодом щелочного лизиса дожен быть с рН именно 8.0?????

Независимо от метода, ТЕ всегда рН 8.0. Можно конечно с 8.5 и даже 9.0, но никак не меньше 8.0. и от метода выделения это не зависит.
Кстати, сейчас весь мир использует только метод щелочного лизиса, а другие остались в 20 веке.

упс... немного некорректно выразилась... я имела ввиду, как именно это значение рН влияет на дальнейший ход работы... ????? сам TE используется как хелатирующий агент... перед детергентом(SDS)...это понятно... но ПОЧЕМУ именно 8.0? какую роль играет это значение?

Никакой. Мелочи в жизни. Для сведения, при понижении рН ниже 8 ЭДТА начинает потихоньку выпадать в осадок или по-другому, при рН ниже 8 ЭДТА не растворяется в воде.
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=265077

У меня точно такая же задача стояла (см. выше). Полный алгоритм выделения, с щелочным лизисом и осаждением спиртом я пока оставил, поскольку он оказался весьма требовательным к чистоте реактивов.
Взял поэтому за основу экспресс-метод http://molbiol.ru/protocol/04_03.html в модификации DNAuser с некоторыми уточнениями:
1. Ресуспендируем в 60 мкл. TE
2. Фенол-хлороформим дважды, потом хлороформим однократно (правда работает это вроде как только на Грам- бактериях: из лизирующих компонентов, как я понял, там только фенол и для толстого пептидогликана Гр+ его, по-видимому, недостаточно).
3. Полученный раствор (~45мкл) + 2 капли минерального масла (чтобы не испарился) прогреваем при 90°С ~4мин. и плавно остужаем (можно в руках) для ренатурации pDNA (иначе на форезе плазмида в виде разных конформаций пойдет несколькими полосами и не там, где надо)
4. Собираем 35-40мкл. из мод масла и хорошо смешиваем в новой пробирке с 5-6мкл. 1x буфера для внесения.
5. Вносим в лунки 0,8-0,9% геля и форезим 2ч. при 5в/см в 1x TBE буфере (гель нужен достаточно длинный).

Выход, конечно, по меркам здешних суровых хтонических молбиологов будет дико слабый и грязный, но для фореза - достаточно.

В принципе можно и на том и на другом - и так и так выход есть видимый. Где больше, где меньше пока не замечал.