Условие:
Вам нужно порезать 1мкг ПЦР-продукта длиной 1,6kb рестриктазой EcoRI. Для этой рестриктазы в ПЦР-продукте имеется 2 сайта рестрикции.
Какое минимальное количество ед. (u) рестриктазы EcoRI вам потребуется для проведения реакции за 1 час?

Для справки:
1.Unit Definition
One unit is defined as the amount of enzyme required to
digest 1µg of lambda DNA in 1 hour at 37°C in 50µl of
assay buffer.
2. Длина lambda DNA приблизительно 48 kb
3. Для EcoRI у lambda DNA 5 сайтов рестрикции.

Ответ округлите до целых чисел

Ответ с 2,5% точностью:   

---

      

/ Сборник задач,  #114205  /

Первые решившие: Urrу, Карамерген, Yeaster, Arkhipenko, Mishanya, Serge, vb, iliaY, Lepra, Demitry

Область: Молекулярная биология (биохимия, генная инженерия)

Характер и уровень: Простые (расч)

Народ вот решает. Некоторые даже получают ответы как у автора. Никто не ругается, что задача не корректная или не правильно решена. Тишь да гладь.
А можно я, как чайник в молекулярно-биологической кухне, задам пару провокационных вопросов.

1. Если так сложилось, что я готов ждать не час, а два часа, то могу ли я взять вдвое меньше единиц фермента?

2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью.

Ответы, если можно, с объяснением.

Спасибо АЕ за справедливую критику.

Да, составитель задач из меня никудышний, не зря так долго не решалась ее писать.
В ответ на провокационные вопросы
1. Да, Вы можете взять единиц фермента меньше, теоретически даже вдвое. Но, практически, фермент с течением времени, и, соответственно, раундами рестрикции постепенно теряет свою активность. Насколько быстро - вероятно зависит от фермента.
2. Нет, не можете, поскольку количество сайтов рестрикции и количество фермента осталось прежними, только в меньшем объеме. С чего бы рестриктазе вдруг начать работать быстрее?

Надеюсь, я ответила на вопросы.

То есть, если разбавить смесь до 25 мл (буфером, ну альбумина добавить, чтобы фермент не инактивировался) - то реакция пройдет за то же время???

В условиях задачи не указано еще некоторые параметры - распложение сайтов рестрикции, наличие star-activity у рестриктазы в данном буфере. Но так ли это важно? Принципиально задача сводится к проверке понимания взаимосвязи между количеством ДНК, ее размером и количеством фермента. Дополнительные параметры необходимо учитывать уже в практическом применении в онкретной ситуации.

Что до влияния объема реакционной смеси на скорость ферментативной реакции - то вопрос сложный и теоретически результат, на мой взгляд, непредсказуем. Вдвое скорость, конечно, не возрастет. Но, с одной стороны, вы сокращаете объем вдвое и уменьшаете промежуток времени, необходимый для встречи в растворе ДНК и фермента, но при этом возрастает вязкость раствора и к тому же увеличивается концентрация компонентов буфера, в котором хранится рестриктаза, что может негативно сказаться на скорости реакции.

Так что задача вполне понятная. Ну, может быть стоит дополнить ее некоторыми ограничениями, чтобы снять спорные моменты.
Еще раз спасибо Ольге.

1. Если так сложилось, что я готов ждать не час, а два часа, то могу ли я взять вдвое меньше единиц фермента?

2. Если я запихал тоже самое в 25µl то могу ли я считать, что за 30 минут реакция пройдет полностью.

В обоих случаях нет, т.к. и там и там изменения не дадут линейного отклика на эффективности реакции. В последнем случае, вообще, может произойти снижение эффективности из-за двукратного увеличения вязкости реакционной смеси...

Да ладно вам прибеднятся. Очень полезная задача

Ну это так, разминка была. Спасибо, что подправили условие.



Количество осталось тем-же, но молярная концентрация сайтов увеличилась. А скорость ферментативной реакции зависит все-таки от концентраци, а не от количества субстрата. Иначе бы в определении единицы не был бы указан объем. Ну и как уже сказала nas, если объем реакции очень сильно увеличить а концентрацию сайтов соответсвенно уменшить, врядле приходится ожидать той-же скорости реакции.

Хорошо, хорошо, давайте по-порядку.
Я думаю с первым вопросом мы разобрались.
Теперь по-поводу второго. Суть вопроса заключалась в том, что если уменьшить объем реакции вдвое, то уменьшится ли время реакции вдвое? Ответ - нет. Соглашусь, объяснение я дала не совсем корректное.
Время работы молекулы рестриктазы состоит из следующих этапов:
1. Распознавание сайта рестрикции на молекуле ДНК
2. Присоединение фермента к найденному сайту
3. Разрезание сайта
4. Отсоединение фермента от ДНК.
Я полагаю, что 2-4 этапы у нас константные, т.к. состав буфера и температура не меняются. Остается 1-й этап.
С одной стороны, если концентрацию сайтов увеличить, то ферменту будет легче найти нужный и времени на это потребуется меньше. С другой стороны, при увеличении количества ДНК повышается вязкость раствора (то, о чем писали Urry и Yeaster), ферменту становится "труднее пробираться" между нитями ДНК, движение молекул в растворе замедляется и время реакции увеличивается. Т.о. если постепенно уменьшать количество реакционной смеси, то вначале мы получим ускорение реакции (но не линейное), потом будет некая точка перегиба (если представить себе график), после чего - снижение скорости реакции.
Кроме того, каждая молекула фермента способна провести определенное количество раундов гидролиза, после чего разваливается/инактивируется.

Надеюсь, такое объяснение публику устроит больше.

Помимо всего прочего, вот одно из определений ед. активности:

http://russia.sibenzyme.com/page.phtml?articlet=30
За одну единицу активности эндонуклеазы рестрикции принимают количество фермента, необходимое для полного гидролиза в течении одного часа одного микрограмма ДНК при оптимальной температуре и в оптимальном реакционном буфере.

Заметьте, здесь указано количество субстрата и не указан объем реакционной смеси, т.е. речь не идет о концентрации (можете обвинить авторов в безграмотности ).

И вот еще полезное замечание
http://www.promega.com/guides/re_guide/chaptwo/2_1.htm
Volume: Viscous DNA solutions inhibit enzyme diffusion and can reduce enzyme activity. DNA concentrations that are too dilute can fall below the Km of the restriction enzyme and also affect enzyme activity. Volume considerations must take into account final ionic strength and must result in glycerol concentrations no higher than 5-10% in order to avoid star activity. Reaction volumes of 10-50µl per microgram of DNA are recommended.

Да разобрались. Кстати, если походить вокруг приведенной вами ссылки можно найти интересную табличку
http://www.promega.com/guides/re_guide/chaptwo/2_2.htm
из которой узнать сохранность активности некоторых рестриктаз во времени. Для EcoRI линейность ответа сохраняется как минимум от 15минут до 4х часов.
Так что на первый мой вопрос ответ Да.



Объяснение меня не до конца устроило (про публику не знаю), однако аргументированно с ним спорить у меня не хватает знаний, но практический вывод меня вполне устраивает.

Еще раз спасибо за задачу.

"Molecular Cloning" 2nd edition 1989: One unit of enzyme is usually defined as the amount required ti digest 1microgram of DNA to completion in 1 hour in recommended buffer and at recommended temperature in a 20 - microliters reaction.