Здравствуйте, коллеги.
Пытаюсь поставить методикеу определения Th1/Th2 на проточнике по экспресси внутриклеточных цитокинов.
Подскажите пожалуйста, как покрасить CD4 на лимфоцитах после активации в цельной крови с помощью PMA и Иономицина? Проблема в том, что антитела BD и Dako не работают.
А может быть внутриклеточные цитокины и не нужны для идентификации? Описаны мембранные антигены для Th1/Th2 (их достаточное количество), в частности CXCR-3 для Тх1 и CXCR-4 для Тх2.
Помогите разобраться.

Дело не в антителах, они скорее всего работают нормально. После PMA и Ion. поймать CD4 очень трудно, они интернализируются с последуюшим развалом. Можно попробывать метить дважды: впервый раз как поверхностные и затем вместе с анти-цитокиновыми. Иногда это помагает. Но уже достаточно давно в такой системе используют комбинацию CD3+CD8+, т.е. ваши CD4 будут CD3+CD8-. Если интересно могу ссылку скинуть. А с поверхностными к Тх1/Тх2 не так все однозначно. И еще из личного опыта, мне с цельной кровью работать не понравилось - грязи много, фонит. Лучше PBMC.
Удачи

только СD3 тоже может интернализироваться и его многие красят после пермеабилизации.

Ellitavi -
вы на правильном пути
- если вы уверены, что концентрация ваших antiCD4 Ab верна (вы их титровали?), то значит проблема со stimulation protocol
- в частности, исходя из вашего описания я думаю что проблема в том что вы не добавляли BFA (Brefaldin A), я делаю по протоколу 5h stimulation = 2h PMA+CaI + 3h BFA и всё работает замечательно, после стимуляции surface staining, permabiliz, intracell staining
я делаю на surface + intracellular на кучу маркёров для NK, DC, HSC & T-cells human & mouse и всё работает, хотя вот вроде CD4 human + cytokine combination не делал - точно помню что делал для мышей

нет, вы на правильном пути!
detection of cytokine production on single cell level - метод выбора для идентификации Th1-Tc1/Th2-Tc2 cells
только по разнице в цитокинопродукции вы чётко можете утверждать что у вас тип 1 (INFg+/IL-2+/TNFa+) и тип 2 (IL-13+/IL-4+/IL-5+),
остальные методы детекции цитокинопродукции стоят после intracell flow (ELISA, ELISPOT, CBA, PCR)
а тем более surface markers

to V & AE -
можно чуть подробнее про интенализацию поверхностных молекул для T & NK?
почему например CD4 интернализируется а CD3 нет? или меньше?
я сколько не красил после стимуляции у меня снижалась только brightness

Про CD3 ничего сказать не могу, у меня с их идентификацией проблем небыло. Небольшее снижение светимости не мешает четко определить сабсет. А про ПМА-индуцированую интернализацию CD4... меня больше интересовало как из этой ситуевины народ выкручивается. А про механизм вот несколько ссылок:

http://www.jcb.org/cgi/content/full/139/3/651
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=A...38d3b37503e4722
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=A...019a5f31474bc2f
http://www.sciencedirect.com/science?_ob=A...72540587d7de6a7
http://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/144/8/3111

Ciao

Спасибо, коллеги!
Если честно, то не ожидал столь быстрых ответов!
Теперь по сути. По технологическим соображениям был выбран протокол BD по активации именно в цельной крови, поскольку предполагается этот тест использовать как рутинный клинический и важно все делать втечение рабочего дня. Активация проводится 4 часа с PMA+Ionomycin+Brefeldin. Все антитела добавлялись после пермеабилизации. CD3 красил и так, и сяк (т.е. и до пермеабилизации и после). Разницы никакой. С CD4 такая же история, но с нулевым результатом.
Ссылку по CD3+CD8- хотелось бы. Но это все равно косвенно и лучше ли это CXCR или другого?
Кстати, какой именно из активаторов заставляет CD4 прятаться?
И еще. Есть ли у кого-нибудь нормы для человека по Th1 и Th2?

Коллеги, а почему вы красите поверхностные маркеры после fix/perm а не до?
Антитела же в таком случае вяжутся гораздо хуже.

Я делал - для human T и NKT - от тимуса - до PBMC.
Правда стимуляцию производил посредством plastic-bound anti-CD3 mAbs.
Прекрасно все видно.
Да, surface staining - до фиксации.
Фиксация - overnight, 2% PF in PBS, +4
Пермеабилизация - cytoperm (сапонин).

Абсолютно согласна, что цитокинопродукция - главное, что подтверждает правильность идентификации Th1/Th2.

Но, т.к. с CXCR4 работаю каждый день (BD, клон 12G5), могу завтра попробовать на обычной цельной крови человека сделать комбинацию CD45/CD4/CD184, просто чтобы развеять ваши сомнения )))

Best wishes

да, тогда понятно в чём косяк,
SURFACE STAINING ПОСЛЕ СТИМУЛЯЦИИ, НО ПЕРЕД ФИКСАЦИЕЙ-ПЕРМАБИЛИЗАЦИЕЙ!
this is essential
а цитокины уже псле перм.
здесь полностью согласен с факсером

Анитела к поверхностным маркерам пробовал добавлять и до перм. и после. CD4 не красится по-любому. Концетрацию брал всякую. Кстати коммерческий набор BD Cytofix/Cytoperm уже содержит фиксатор (скорее всего PF), но и после него все, что красил (кроме CD4) было ОК.
Согласен с Libra, что цитокиновая продукция - это главное. Однако используя CXCR-3 (Th1) и CCR-4 (Th2) вместе с внутриклеточными цитокинами, мы можем одновременно оценить и фенотип клеток, и их функциональную активность.
Поробовать бы еще покрасить CD69 вместо CD45, CD4/CD69/CD184.
И еще. Кто-нибудь работал с Tim-3 и ST2L/T1? Говорят, что у них высокая специфичность именно к Th1 и Th2.

Активацию сделайте по CD3 или по TCR+CD28, а не PMA - статьи же вам выложили по сабжу.
А антитела к поверхностным маркерам добавлять надо не до пермеабилизации, а ДО ФИКСАЦИИ.
И эритроциты лизировать. И FcBlock на всех стейнингах ююзать- иначе будет фуфло.

Ну что же, как говорится, ч.т.д...

Кровь, муж, 23 г, без ВП и патологий (астма и т.п.)
Пробоподготовка: lyse-two-wash (BD Lysing Solution и Сell Wash)
Антитела: CD45/CD14, NC, CD3/CD4/CD184

CD3+ среди ЛФ - 71,0%
CD3+CD4+ - 35,5%

CD184+ от CD3+CD4+ - 99,72%. очень яркая экспрессия, четкий кластер, без намека на разделение...


Так что, цитокинопродукция - FOREVER )))

А CD69 у меня, к сожалению, нету...

Дык, нормальный кит+ правильный протокол+ руки= правильный резалт

to Ellitavi, и остальным -
а можно ссылки на работы по поверхностному маркированию и разнице между Т1 & T2 (да да я про ансамбль хемокиновых рецепторов)
буду очень благодарен,
это очень интересно,
может их сразу сортануть из свежака и вести в культуре типа 1 и 2, чем поляризовать смесь или Т-0

спасибо

Леха, связь есть - но не стабильная.
Это примерто так же, как у iNKT с common NKT/NK surface antigen: вроде бы хорошоткореллирует- но для сортинга лучше не юзать, ибо много лишних клеток будет.

Я обычно так и делаю. Если планирую красить внутриклеточно, то ре-стимулирую форболом на ночь, а на последние 4 часа добавляю либо монензин, либо брефелдин, чтобы внутри подскопилось побольше.
Если антитела не обязаны работать на фиксированных клетках, то красить поверхностные антигены нужно до фиксации.

to yMHuK -
а по каким маркёрам вы сортируете Т-1 и Т-2???
и потом вы их не культивируете? а сразу стимуляция?
и какие цитокины они экспрессируют после сортинга?

постулировано выше!
no doubt