Помогите, как выделить лимфоциты ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ крови мышей! Проблема в том, что ее (крови) в мыши маловато..(( Если кто знает, киньте протокол..
И вопрос номер два: как эти лифмоциты активировать, кроме конканавалина?
Заранее, спасибо!
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
Как выделить лимфоциты?
Mav-lik, 20.11.2006 21:18
Cells-nnm, 21.11.2006 03:09
да проблема с количеством клеток будет тут №1
с периферии много не наковыряешь,
смотря какая вас purity интересует и какие инструменты в руках?
в принципе чистоту > 90% по CD3+ могут обеспечить методы -
сортинг -MACS, FACS; если нет инструментов/денег, могу кинуть простой протокол - panning - я его давно делаю - CD3+ purity 90-95%, нужно купить только одни антитела...
с периферии много не наковыряешь,
смотря какая вас purity интересует и какие инструменты в руках?
в принципе чистоту > 90% по CD3+ могут обеспечить методы -
сортинг -MACS, FACS; если нет инструментов/денег, могу кинуть простой протокол - panning - я его давно делаю - CD3+ purity 90-95%, нужно купить только одни антитела...
Mav-lik, 21.11.2006 17:32
Да, да, да, киньте протокол! Пожалуйста!
Cells-nnm, 22.11.2006 02:33
reagents:
- Ab: Goat-anti-mouse IgG (whole molecule) - "Cappel", MP Biomedicals Inc, 2mg solution. cat. # 55479
- BSA buffer (0.1% or 0.5%BSA in PBS)
method:
1. prepare Ab dilution 1:200 (0.25 ml/50 ml PBS)
2. cover petri dishes 25 ml of Ab solution for 150 mm dish
3. incubation on flat surface 1h RT
4. poor off Ab and wash dishes PBS 3 times
5. block with 10 ml BSA buffer (on 150 mm petri dish)
6. incubation on flat surface 1h RT
7. add mouse MNC approx. 100 millions per one petridish in volume = 4 ml (total volume in dish= 10 ml BSA buffer + 4 ml. single cell suspension = 14 ml.), shake gently
8. incubation 1h +4C on flat surface
9. examine plates under microscope to be sure that the Ig+ cells adhered
10. pour off the T-cells gently into a 50ml tube (no resuspended!!!)
11. wash plate 2-3x by BSA buffer very-very gently (no resuspend!!!!)
12. spin down Ig- cell suspension, resuspend in medium and count
----------------------------------
* методика опробирована на селезёнке, как это будет работать на периф. крови я не знаю
** чистота CD3+ при правильном выполнении протокола ~ 90%
*** в протоколе все данные расчитаны на 150 mm чашки петри (~ 100 млн. (1 селезёнка) клеток на чашку), для крови - пересчитывайте, возможно и 90 mm чашки будут великоваты
**** u can re-use Ab sol 3 times, keep it sterile
- Ab: Goat-anti-mouse IgG (whole molecule) - "Cappel", MP Biomedicals Inc, 2mg solution. cat. # 55479
- BSA buffer (0.1% or 0.5%BSA in PBS)
method:
1. prepare Ab dilution 1:200 (0.25 ml/50 ml PBS)
2. cover petri dishes 25 ml of Ab solution for 150 mm dish
3. incubation on flat surface 1h RT
4. poor off Ab and wash dishes PBS 3 times
5. block with 10 ml BSA buffer (on 150 mm petri dish)
6. incubation on flat surface 1h RT
7. add mouse MNC approx. 100 millions per one petridish in volume = 4 ml (total volume in dish= 10 ml BSA buffer + 4 ml. single cell suspension = 14 ml.), shake gently
8. incubation 1h +4C on flat surface
9. examine plates under microscope to be sure that the Ig+ cells adhered
10. pour off the T-cells gently into a 50ml tube (no resuspended!!!)
11. wash plate 2-3x by BSA buffer very-very gently (no resuspend!!!!)
12. spin down Ig- cell suspension, resuspend in medium and count
----------------------------------
* методика опробирована на селезёнке, как это будет работать на периф. крови я не знаю
** чистота CD3+ при правильном выполнении протокола ~ 90%
*** в протоколе все данные расчитаны на 150 mm чашки петри (~ 100 млн. (1 селезёнка) клеток на чашку), для крови - пересчитывайте, возможно и 90 mm чашки будут великоваты
**** u can re-use Ab sol 3 times, keep it sterile
Cells-nnm, 23.11.2006 07:26
а вообще с кровью эта метода такой чистоты не даст, на периферии же полно всего - моноциты и грануло-, NK
это в селезёнке просто - там почти весь орган B- и Т-клетки (после лизиса),
но может 60-70% получите, мне интересно было бы если бы вы эту методику на периферии поставили и сравнили
а ещё лучше было бы сравнить эту методу с сортингом, интересно где потери клеток будут выше?
удачи
это в селезёнке просто - там почти весь орган B- и Т-клетки (после лизиса),
но может 60-70% получите, мне интересно было бы если бы вы эту методику на периферии поставили и сравнили
а ещё лучше было бы сравнить эту методу с сортингом, интересно где потери клеток будут выше?
удачи
Дядя ФАКСер, 24.11.2006 00:48
(Cells-nnm @ 21.11.2006 00:09)
да проблема с количеством клеток будет тут №1 с периферии много не наковыряешь,
смотря какая вас purity интересует и какие инструменты в руках?
в принципе чистоту > 90% по CD3+ могут обеспечить методы -
сортинг -MACS, FACS; если нет инструментов/денег, могу кинуть простой протокол - panning - я его давно делаю - CD3+ purity 90-95%, нужно купить только одни антитела...
Лучше- по pan-CD45- мультистепом на МАКСе- а потом- уже думать, что далее.
Либо - BD-шный whole-blood I-mag T selection kit
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.