Хочу сделать ПЦР,но вот какие ферменты купить, совсем не знаю.Полазил по прайсам,цены отличаюся чуть-ли не на порядок.Хотел купить в Сибэнзиме,но начальник говорит, что дешевую полимеразу покупать нельзя,боится что не будет работать.И еще слышел,что бывает с антителами ,и что ее проще использовать.
И буквы,магний и т.п.где можно купить?
Может кто-нибудь посоветует?Заранее благодарен.

Мы пользуемся пущинской полимеразой,она защищена антителами -перед использованием просто надо прогреть,набор на 1000 реакций что-то около 1000 рублей.При СИБЭНЗИМ ничего не знаю.

буквы можно купить в ферментасе - они нормальные. Полимераза - смотря какую Вы хотите proofreading чи ни. В сибэнзиме не надо покупать ничего - половина не работает. Магний годится любой ACS grade. Сульфат, не хлорид. Трис, аднака нужен чистый. И ацетат калия или сульфат аммония приличный.

To Veshka: А почему Mg - сульфат, а не хлорид???
Мы используем MgCl(2) фирмы "Sigma", продается в виде одномолярного раствора.
Про антитела: Полимераза, связанная с антителами, не работает до тех пор, пока антитела не денатурируют и не отвалятся при нагревании. Этим обеспечиваетс "hot start" ("горячий старт") в реакции - т.е. полимераза активизируется во время денатурации в первом цикле, для чего перед первым циклом ПЦР лучше добавить прогрев в течении 2-3 минут при 94 град на том же термоциклере. Нагревать просто полимеразу перед употреблением не надо! Весь смысл этой полимеразы - именно в "горячем старте", что предотвращает неспецифичный отжиг праймеров, их залипание само на себя, образование шпилек и т.п.
Такая полимераза - вещь, конечно, хорошая, но дорогая, поэтому в повседневной жизни, если праймеры хорошие и специфичные, она не обязательна.

Про Сибэнзим - буквально пару дней назад я сравнивал его и Promega (простые таги) - и на уровне качества продуктов разницы не заметно. Впрочем надо смотреть разицу на больших гелях...

2imers а потому что сульфат лучше это в неявном виде много где написано. да и просто посмотрите на состав буферов в большинстве фирм. А ещё лучше - глутамат. Но не всегда . Hot start антителами это баловство. Я предпочитаю купить дорогие KOD или геркулазу если что-то длинное и сложное, а хотстарт уж вручную. Это просто ведь

Извел целый Сибэнзимовский PCRный кит, никаких претензий не имел. Впрочем, у меня были весьма тривиальные задачи. Зато несколько дешевле Promegи.

Дорогой друг, все зависит от поставленой Вами задачи, т.е. что хотите ПЦР-ить, какой размер продукта и откуда. И в каких количествах. Я например пользовался Taq-pol и фирмы Силекс-м(Россия), и Биомастер^овской, и Синтол^овской, особой разницы я не заметил. Если праймеры специфичные и хорошо подобраные, если в master mix не добавлять DEPC, или какую-то другую гадость, так все должно пройти нормально :-)))
Буквы хорошо работают Биомастеровские, Mg у кого не покупал, тоже работал хорошо.
А что касается вышеупомянутых изысков, то это уж и впрямь баловство, можете конечно ПЦР^ить 300bp long reading полимеразой, будет читаться, но это уж из пушки по воробьям:-)))
P.S.: А фермент, только купленый всегда имеет смысл сначала проверять, да и положительный контроль Вы ведь ставите. Тогда какие разговоры о неработающих ферментах? В моей практике например такого еще не было. И холодильники размораживались на выходные (ЧП), а Taq все работал и работал:-)))

Считается, что хлорид ингибирует полимеразу

to: imers
а кто предлагал нагревать полимеразу отдельно? %))

Насчет хлорида и сульфата - большое спасибо, учту! Действительно, ведь и в буфере сульфат аммония, но почему-то мы исторически используем хлорид - что меня и раньше смущало.
To MrDmitry: Я-то догадываюсь, что Вы не предлагали нагревать полимеразу с АТ отдельно. Но догадается ли начинающий по такой формулировке "перед использованием просто надо прогреть"? ;0)

Согласен с Petr. На сегодняшнем этапе нет "ПЦР вообще". Есть конкретные задачи с конкретными рекомедациями. Ну и если в ПЦР нет никакого опыта - то пойти поучиться на сторону. Лучше один раз увидеть ...

в принципе,у Вас довольно тривиальная задача .Вам надо просто подобрать праймеры на Ваш участо геномной ДНК, что в принципе не такая простая задача -надо брать 28-30 не менеее,далее нужно проверить на образование шпилек,димеров и т.п.,затем вам нужно подобрать сонцентрацию СА,буфера,полимеразы и т.п.,чтобы получить некоторое количество продукта,если Вы хотите делать SSCP.Затем (через 1-2месяца)если все пройдет гладко,Вы уже примерно будете оценивать Ваш продукт не просто, а по сравнению с чем-то,а например с ДНК в воде для буфера .И еще Вам нужно взять более-менее работающую полимеразу и т.п. Успехов,если что-пишите!

Я давно пользуюсь Сибэнзимовскими реактивами не только в силу их привлекательной стоимости но и в силу близости расположения поставщика(живу и работаю в Новосибирске)не каких притензий к качеству ни я, ни многие мои коллеги по институту не имеем, а что касается ПЦР лучше один раз увидеть как это делает крутой спец, чем сто раз услышать ...

Советую обратиться в "Медиген", г.Новосибирск, у них много качественной продукции для ПЦР. Ферменты, трифосфаты, наборы и т.п. Притом дешево. Сайт www.medigen.ru, там вся информация.
Успехов

to aleksm/imers

Ув. Коллеги.
Вы бы не могли более подробно (со ссылками) ещё раз про ингибирование полимеразы хлоридом. Дело в том, что у фирмы Promega, например, в буфере у Taq полимеразы всю жизнь хлорид. Пользуюсь и не жалуюсь.
<img src="graemlins/shuffle.gif" border="0" alt="[смущение]" />

Be sure you've got a proper polymerase for your task. I just mean there's Vent or deep Vent... Sorry if the advice's looking stupid as well as for writing in English not Russian.

Здравствуйте!
Наш центр занимается ПЦР уже более десяти лет! Taq-полимеразу выделяем у себя сами и особой разницы с фирменной не замечаем, поэтому если Вы хотите заниматься ПЦР в серьез есть смысл наладить производство Taq-полимеразы и синтез праймеров у себя (если конечно позволяют средства). Всю жизнь использовали MgCl2 и буфер для реакции содержит KCl. Имеем очень хорошие нароботки, а тагже проводим обучение, к нам приезжают люди почти со всей Украины и с России.
Если нужна дополнительна информация, спрашивайте ответим.

Ингибирование хлоридом ПЦР-глупость. Сульфат магния используют из следующих соображений- продажный MgCl2 x 7H20 не гигроскопичен и может быть использован для ТОЧНОЙ навески. Продажный MgCl2 x 6H2O сильно гигроскопичен и приготовленные из него растворы ВСЕГДА следует проверять по другим параметрам, например 0,5 М MgCl2 имеет проводимость 78 mS.

Не-а, не глупость. Вы, просто, наверное, со сложными PCRs, которые действительно надо оптимизировать дела не имели.

F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.

Removals Company | Removals Company | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling

Yet in the days ahead 1688.comit will be tempting to dismiss ufabet เข้า สู่ระบบMoscow’s broadened claims ufabet168cof sovereignty and บอลสเต็บsaber-rattling as the dying แฮนดิแคปthroes of an empire ลิงค์รับทรัพย์that forgot to look under the hood UFA1688before it went driving in a storm. สล็อตออนไลน์This is a win or lose moment ราคาบอลfor Putin, and he does not see ufa1688a future in which he loses.