Совсем недавно, в марте, обсуждалась эта тема. Однако есть еще несколько вопросов к опытным лабораторам.
1. можно ли использовать стриппинг после проявки с помощью Alkaline phosphatase conjugate substrate kit (красится прямо мембрана)
2.какой метод подходит в этом случае.
(варианты методик я вытащила из того предыдущего топика):

i.From Anya с DTT
63mM Tris-HCl, pH 6.8
2%SDS
DTT 1%
50C, 40 min, na shejkere

ii. меркаптоэтанол
62.5 мM Трис, pH 6.7;
2% ДСН;
100 мM β-меркаптоэтанол,
30 мин при 50С
после чего промыть 2 раза TBS-T буфером

iii. вариации на тему "кислый глицин"
0,2M Gly
2%SDS, pH 2,5 (HCl)
30min room temp (PVDF membrane, AP-conjugated secondary ab)

то же но 37 градусов, 20 - 30 минут на качалке

RT на ночь

iv.вариации на тему "NaOH " (от J, Olegovitch и др.)
0.1 М NaOH
пару минут

0,2M NaOH,
10-30min room temp (Nitrocelulose membrane, HRP-conjugated secondary ab)

Вариантов слишком много. Посоветуйте, что выбрать.

Глицин без SDS, это что бы вам жизнь медом не казалась.

А вот материала у вас на еще один блот нету.
Лучше переделать блот.
А еще можно просто покрасить без стрипинга др. антителами из др. зверя и для проявки использовать пероксидазный коньюгат. Это так для разнообразия.

Дело сложнее.
Материал есть, но
во-первых, для этой задачи важно делать именно на той-же мембране. тогда я буду уверена, что соотношение белков на дорожках не изменилось. (см. соседнюю тему )
во-вторых, надо попробовать освоить новое

Если использовать пероксидазный коньюгат, я смогу отличить полосы от первых антител и последних? И нет ли у Вас ссылки, как делается такая проявка? Я с таким не сталкивалась.

1. если Уу Вас большой фон прямо на мембране то еще дело в неправильной забивке если молоком поменяте на БСА и наоборот...
2. ECL solution:
100mM tris pH8.6
125mg luminol, 155 mkl H2O2 V=500ml
2. ECL enhancer:
11mg p-coumaric acid in 10ml DMSO
Mix 1V of ECL solution and 0.1v of enhancer....
если не люминисцентно проявлять пероксидазу по тогда использовать надо 4 хлор-нафтол....
С ходу концентрации и буфер не помню посмотрите в инете "4CN"

>Во-первых, для этой задачи важно делать именно на той-же мембране. тогда я буду уверена, что соотношение белков на дорожках не изменилось. (см. соседнюю тему )
во-вторых, надо попробовать освоить новое.

А, ну, понятно, резвитесь. Ню, резвитесь.

Фона нет

Спасибо, посмотрю.

Я сделала стрипинг с меркаптоэтанолом.
45 мин при 50С на качалке
62.5 мM Трис, pH 6.7;
2% SDS;
100 мM β-меркаптоэтанол,
Мембраны стали фиолетового цвета, все полосы остались.
На сколько я понимаю, и краска и антитела должны были отмыться.
В чем может быть дело?

"Стукните его и он станет фиолЭтовый!"

Есть опасение, что краску убирать замаетесь. Она специально подобрана такая липкая, дабы пятно по мембране не расползалось. Но если будете делать люминесцентную регистрацию, то она Вам и не помешает.

Tom1 посоветовал подробнее описать, как делала стриппинг

У меня PVDF мембраны
Проявку делала с помощью Alkaline phosphatase conjugate substrate kit
После проявки высушила
Сделала раствор
62.5 мM Трис, pH 6.7
2% SDS;
100 мM β-меркаптоэтанол
[pH я не доводила, разбавляла дист.водой 1M Трис pH 6.8]
в чашку петри налила 20мл. этого р-ра.
Положила туда 2,5 мембраны
45 мин при 50С на качалке
Когда я вытащила, мембрана и раствор были фиолэтового цвету. Полоски остались. Потом промывала в PBS-T, цвет остался.
У меня впечатление, что это частично ушла краска с полос, но осела на мембране.

Три предложения:
1. Заменить PBS-T на TBS-T
2. Мембрану не сушить
3. Посли проявки, перед стриппингом, мыть в TBS-T

Если хотите продолжать SDS, то уберите МЭ из буфера, или сначала проварите буфером без МЭ 20' вылейте его и потом добавте свежий буфер с МЭ.

Но можно просто перейти на глицин.

Лучше мембрану не сушить. Если же сушите ПВДФ мембрану, то перед стриппингом ее надобно заново вымочить в метаноле, далее пополоскать в PBS-Т, а затем в стриппинг буфер. Попробуйте перекрасить ту же мембрану после стриппинга со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой и далее ECL (вам уже советовали). Никакой разницы по окраске между PBS-T и TBS-T нет.

Проблема в том, что ECL в лабе сейчас нет. Отсюда такая головная боль и варианты: или продолжать пробовать с ECF, или ждать ECL...

Гест была я : ) Если вы из СПб, приходите к нам, я вам дам ECLных стоков, на первое время хватит. Рентгеновская пленка и вторые антитела есть?
aibri@mail.ru,
я из ЦИНа

Аня, спасибо большое! Из СПб мы!
И пленка и вторые Ab у нас в том же проэкте, что и ECL . Пленку, я думаю, мы вот-вот купим. А вот антитела - если сможете немного и с этим выручить, это было бы здорово! Нужны анти-кролик и анти-мышь.
Я вам напишу на мейл.

пишите, антителами выручу

Аня, большое спасибо за предложение.

Mariah

As with all writing บาคาร่าออนไลน์ the language should be slot xo suitable for the audience. 11hilo the language will need to be สล็อต While each has specific 123GOAL easy for that age group to understand

but also exciting and lively nigoal enough to make them ลิงค์รับทรัพย์ common characteristics. พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง want to read it. ราคา บอล Each section has a heading Hotgraph that outlines the main topic