Дорогие коллеги! Проблема в следующем: тащу ген кукурузного белка (растворимый цитокининовый рецептор)с помощью проклонированной кДНК библиотеки в колях. Есть моноклональные антитела на рецептор. Проскринировав кучу чашек выделил несколько клонов, которые (на чашках!)дают превосходный сигнал. Однако на блоте (периплазма и тотальный лизат)нет ничего!!! Я удивлен как минимум. Проверил вставку- 2,5 килобазы, все в порядке, на небольшой белочек тянет. Однако даже суперпродукции не наблюдается "чего-то там", хотя конструкция в порядке (многокопийная, промотор нормальный, миниантитела идут - песня!). Видимо что-то с экспрессией. Но на чашках колонии дают очень хороший сигнал! Откуда тогда он там берется? У меня много предположений, нужно еще многое проверить, но может кто-то сталкивался? Заранее всем спасибо.
Anonymous, 20.01.2002 23:45
Вариантов может быть несколько. Первое. Антитела, если они не секвенциальные, вполне могут в блоте не взаимодействовать с денатурированным белком. Второе. Как белок экспрессируется - в растворимой форме или нет? Если тельца включения точно есть (обычно видны на фазово-контрастном микроскопе), то какова их растворимость? Могут быть проблемы. Третье. Обычно у рецепторов есть сигнальный пептид для транспортирования к мембране, который потом отщепляется. Большинство таких последовательностей узнаётся протеазами кишечной палочки как сигналы для ускоренной протеолитической деградации. Ситуация может быть следующей: белок есть, пока он нерастворим, а как только начинает растворяться, то его съедают, даже в лизате. Хорошие моноклоны в этом случае дают полоски на блоте в низкомолекулярных областях. Четвёртое. Похоже на третье - какая-то последовательность (чаще на N-конце) служит сигналом для протеолиза. Навсскидку в E.coli RSQPAG, хотя могу и ошибиться. Ну и последнее - что-то ещё. Удачи
Anonymous, 21.01.2002 19:09
Очень похоже на то, что белок действительно деградирует, так как аномально сильно окрашивается фронт... Надо еще раз поставить периплазматические контроли. Они многое покажут. AVS! Спасибо за поддержку!
moonlife447, 25.09.2022 12:07
F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.
On the network’s flagship aff 1688evening newscast, ทางเข้าufa1688Xi was shown wearing ufabet เข้า สู่ระบบa face mask and viewing ufa1688the displays at the Beijing ราคาบอลExhibition Hall where photos สล็อตออนไลน์of himself featured heavily. UFA1688He was accompanied by Premier ลิงค์รับทรัพย์Li Keqiang and other top leaders, แฮนดิแคปincluding all members of the party’s บอลสเต็บsupreme Politburo Standing Committee.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.