Всем привет.
Босс недавно сказал, что существует методика, позволяющая выделять гематопоэтические клетки из костного мозга спинного мозга (а не костей конечностей, как обычно). Якобы таким образом с одной мыши можно собрать раз в 10 больше, чем обычно. Это открывает большие возможности для экспериментов, где обычно нужно очень много мышей.
К сожалению, босс ничего не знает о подробностях этой методики. Поиск в PubMed тоже ничего не дал. Если кто-то знает, не могли бы вы поделиться, как это делать? Насколько больше клеток можно выделить? Нет ли существенных примесей клеток из других тканей? Или они есть, и в экспериментах использовать эти клетки можно только покрасив, к примеру на c-kit (мне нужны предшественники, а не дифференцированные клетки в конечном счете)? Элиминирует ли 5-FU дифференцировавшиеся клетки так же эффективно, как и в костном мозге костей конечностей?
Если кто-то знает ответ на один или несколько из этих вопросов и сообщит его, буду премного благодарен.

я видел как все кости конечностей + позвоночник давили в фарфоровой ступке пестиком в среде ДМЕМ. Давили в два подхода, со сменой среды. потом де,рис оседал в 50 мл пробирке , супер с клетками пропускали через 40 мкм стайнер , откручивались клетки- получался осадок bone marrow. разумеется так получаются тотальные клетки косного мозга, а не очищенные stem cells.
Можно собрать в 3-5 раз больше клеток костного мозга с одной мыши- во первых много из позвоночника, а во вторых, когда промывают бедра, много мозга остается в эпифизах костей, а когда кости давишь- все выходит. существенных примесей нет.

Большое спасибо, попробую.

to Griva -
спасибо за методику, очень интересно, не слышал

to DmitriM -
5-FU убивает cycling гемопоэтик, поэтому среди гемопоэтических СК у вас останутся LSK34- (=lin-/sca-1+/c-kit+/CD34- = LT-HSC) в фазе цикла G0, т.е. дормантные,
но со временем хронических ip-инекций 5-FU их пулк тоже истощится и мышь помрёт
только c-kit+ total охватывает разные субпопуляции гемопоэтических клеток - включая стволовые и прогениторные
действие 5-FU на КМ универсально и на клетки КМ из позвонков он должен действовать так же

можно более детально обсудить в зависимости от целей и задач

уточнение насчет методики- сначала давят в среде, потом пипеткой гоняют, потом этот товар без осевших костей на селл стрейнер уже......

насколько я понимаю, 5-fu убивает все активно деляшиеся клетки (к которым HSC не относятся). соответственно, после инекции 5-фу много всего дохнет, и типа HSC начинают делиться, чтоб заполнить место. это мое высоконаучное понимание проблемы

то, что останется в мыши после 5-fu, будет содержать более высокий % HSC. более того, это фуфло можно нарастить до огромных количеств в среде с il-3/6/scf. после 7-10 дней култивирования это дело может восстановить весь гематопоез в облученной мышке (проверено)

что касаемо выделения клеток мозга - мне обычно лень заморачиваться с прмыванием костей шприцом и прочей ерундой. поетому я вставляю кости в 200 ul типчик, четыре типчика вставляю в факсовскую пробитку и кручу это дело 45 секунд в центригуге (не в большой, а в маленькой, надо, чтоб она обороты быстро набирала). обычно выход из двух ног - около 50*10^6 (зависит от возратса.

кто-нибудь знает какое количество клеток из костного мозга обычной мыши эквивалентно 10000 таковым из 5-fu мыши - в плане динамики восстановления кроветворной системы после трансплантации этих клеток летально облученным реципиентам?

to Glebber -
HSC относятся к активно делящимся клеткам при беде, а в норме - делятся но не очень активно, прогениторы гораздо активнее.
ты правильно понял 5-fu будет force to division of dormant HSC (=G0/G1) to cycle, потому как беда, все делящиеся умирают и надо восполнять, но бесконечно это продолжаться не может и мышь сдохнет всё равно, HSC не могут быть self-renewing unlimited
по in vitro экспансии HSC - то что вы говорите в принципе любой школьник сделает - сейчас коммерческие коктейли продаются - купил накапал в среду и собирай урожай, но
это у вас не абсолютное увеличение LT-HSC и даже ST-HSC, это у вас бурное деление прогениторов, к которым понятие self-renewal уже никак не относится,
а истинные HSC тоже увеличатся в количестве, но относительно и может быть раза в 2-3,
мышь такая смесь конечно восстанивит, потому как в ней будет хотя бы одна LT-HSC, single cell HSC transplantation было давно сделано в нескольких лабах, так что достаточно и одной клетки...
а размножить самообновляющиеся LT-HSC хотя-бы раз в 10-20 вроде ещё никому не удавалось - всё равно всё уходит в дифференцировку и получается куча прогениторов

Я попробовал методику, правда, еще до обработки 5-FU. Из одной бедренной косточки небольшой мышки у меня получилось 11 миллионов при промывании шприцом и 14 миллионов при давлении в гриндере. Клетки совершенно одинаковые. Думаю, после обработки 5-FU будет разница больше, так как ниша, как тут упоминали, у HSC в эпифизах костей.
Что касается 5-FU, то о нем я, в общем-то, не спрашивал, так как у нас в лабе это стандартная обработка и о эффектах 5-FU мы знаем не понаслышке. Действительно, убиваются прогениторы, дифференцированные клетки за 6 дней (с момента инъекции) сами умирают, так что остаются HSC (экспансия и вправду небольшая - раза в 2, если не меньше), а также более-менее продвинутые прогениторы где-то до уровня GMP, то есть все еще лишенные lineage-specific markers.
Горькая правда.
С позвоночником у меня ничего не получилось чего-то - клеток было мало и вообще куча какой-то фигни.

P.S. В моих предыдущих постах вместо "спинного мозга" следует читать "позвоночник".

ниша HSC везде есть в КМ - и в эпифизах и в диафизах - это понятие клеточно-биологическое и подразумевает совокупность клеток и их взаимодействие, поддерживающие HSC в "стволовом состоянии" и обусловливающее миграцию, лоджинг (заякоривание) и энграфтмент HSC.

ты имел в виду свою нишу - анатомическую, но такого понятия в контексте HSC не существует
я где-то видел методики выделения КМ из эпифизив - ищи в пабмед, позиционируется что клеток больше, а вообще конечно больше всего будет если при заборе костей сохранять эпифизы, потом их отрезать в худе и давить в гриндере, а диафиз промывать в пробирку (в чашке петри говорят чуть больше потери), потом всё это смешать и получите большее количество клеток, чем только при промывке диафизов.
по количеству - около 50 миллионов с 1 мыши - 4х костей (только промывка диафизов) - обычно получается,
обычно такого количества достаточно для очень-очень многих экспериментов
если у вас получается меньше гораздо, то оттачивайте методики,
а 11 или 14 разницы не вижу, у второй мыши может её и не быть...

To Glebber, очень интересная методика (выделять мозг из кости центрифугированием). А какая нужна центрифуга (например Eppendorf 5702 R годится). И какая скорость.

центрифуга iec micromax с ротором для 4 ml пробирок, 4000 rpm, 45 sec. v принципе, работает и в обычной большой центрифуге, но иногда кончик типчика забивается, и, такое ощущение, что не все вылетает. я думаю, что вам сгодится любая центрифуга, которая набирает быстро обороты (т.е. чем меньше ротор, тем лучсе)

делал вчера несколько позвоничников- подтверждаю- клеток получилось до фига

А при вышеуказанном методе проблем с контаминацией другими типами клеток- не наблюдается? Ведь косточки от мышц и прочего джанка- полностью не очистить.

главное не переусердствовать с пететиранием, как только кости поломаны, костный мозг уже выходит. кроме того все пропускается через cell strainer- он все таки куски обычной ткани и стромы сильно задерживает .
я смотрел под микроскопом- выглядит как обычный bone marrow. Я использовал для пересадок этот костный мозг и для graft vs host модели.
Я думаю что если для пересадок- то чистота вполне отличная. а если для именно выделения стволовых клеток- там все равно еще очень длительная очистка и возможные небольшие примеси (я не уверен что эти примеси вообще есть) никак не скажутся. все равно товар сортировать....

Через стрейнер- я и после тривиальной перфузии все пропускаю.
Другое дело, что микроскоп- все ж не критерий...

от контаминации другими клетками- никуда, особенно при раздавливании позвонков,
НО не важно какую смесь вы сажаете в летально облучённую мышь - важно чтобы она выжила и восстановила гемопоэз, а это значит что в вашей смеси есть HSC и произошёл успешный энграфтмент - для большинства экспериментов в BMT только это и надо...

А, ну ежели все "заточено" под один модельный эксперимент....
Мне то КМ для других целей нужен просто - потому хочется чистоты.

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=M...=/sdarticle.pdf
И по теме:
http://www.jove.com/index.stt?comp=c18jdh4...VID=119&ent=801

очень хороший протокол,
спасибо Дима

по нишам - они есть и в диафизах и в эпифизах - ты же из диафиза по любому BM намываешь, просто в эпифизах скопление BM - ты это можешь увидеть и глазом - они красные, а чем дальше от эпифиза тем кость белее,
поэтому они и показали ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЙ траффик и лоджинг в эпифизы длинных костей
поэтому понятно почему сейчас стали больше гоняться за суставами и использовать протоколы как показано в видео для выделения BM вместо обычной промывки диафиза

вопрос к тебе -
выделяли HSC после 5-FU? интересно какой там энричмент у вас, я собираюсь скоро это делать, правда просто lin-

Слушай, ну такое ощущение, что ты никогда кость мышиную не видел. Нормальную кость, не из лейкемической мыши, а самой обыкновенной. И статью перечитай еще раз, обратив внимание на эксперименты по трансплантации клеток в мутантных мышей с дефектом в образовании HSC. Они остаются только в эпифизах в течение 120 дней, так и не распространяясь. То есть не только хоуминг там произошел, но и энграфтмент.
К сожалению, я никогда не мерял количество c-kit+ клеток (не говоря уж о других маркерах) сразу после выделения. У меня клетки находятся в культуре до анализа от 72 двух часов и даже больше, так что дифференцировка вовсю происходит. Если же говорить о цифрах через 72 часа, то порядка 5% клеток все еще c-kit+, хотя это, конечно, не значит, что они все HSC. Но это все, что я знаю, sorry.

ok,
тогда вопрос по другому сформулирую -
скока у тебя total BM (exclude RBC) на одну мышь после заколки 5FU - интраперитонеальной, внутривенной и через сколько дней курса (к-ва инъекций)
что-то я сегодня никакого энричмента по lin- не почувствовал из 3-х мышей только 400 000 клеток после колонки из 60 миллионов тотал = 0.8% ужос
правда контроля не было, но нокаут хороший, в нём в 10 раз больше HSC бывает