Полная версия страницы  English  

Выделение мРНК и "незаконная экспрессия"

imers, 29.01.2002 07:08
Уважаемые коллеги!
Если кто-то выделяет мРНК китом Promega "PolyATtract® System 1000" (она тащит мРНК за polyA-хвост) - подскажите, какой длины мРНК удается выделять? В описании кита - только оценка количественного выхода. Опыт в нашей лаборатории показывает, что первые экзоны с мРНК длиной 4,5 килобазы еще амплифицируются. А 10 килобаз, интересно? Отрывается начало от polyA-хвоста в процессе выделения, или нет?
Понимаю, что этот способ выделения - в моем случае не лучший, но другого у под рукой пока нет (а вот лимфобласты уже ждут... frown.gif .
И еще вопрос - если кто-то вытягивает "незаконную экспрессию" (illegitimate transcription) - какими (и чьими) китами Вы пользуетесь? И как: RT-PCR, или RT (со специфичного праймера? или с random?), а потом PCR? Если так (отдельно RT и PCR) - то какой фермент лучше брать для RT? (у нас есть M-MVL, но неизвестно чей, и совсем мало AMV, но Promega). Сколько циклов ПЦР Вы делаете, какова у Вас максимальная длина получаемого ПЦР-продукта?
Мне нужно вытащить (в виде пересекающихся ПЦР-фрагментов) мРНК нейронального белка общей длиной около 10 килобаз, причем в качестве источника РНК доступны только или свежая кровь, или лимфобласты.
Буду очень признательна за любые советы и помощь информацией!
(статьи уже читала, но прошу совета у тех, кто этим занимается здесь и сейчас).
Кис, 29.01.2002 11:49
1. Смотрим illegimate со специфичными праймерами на предмет верификации мутаций сплайсинга. РНК - из периферической крови, тотальная. Ген в норме в лимфоцитах если экспрессируется, то очень слабо. RT-PCR с синтезом кДНК с random праймером, ревертаза - от НИИ сельхозбиотехнологии. Фрагменты нас интересуют короткие - так что больше 1 килобазы нам не нужно.
2. А замчем все это нужно ? Насколько помню из предыдущих сообщений - ген Вам известен и какой-то кусок сиквенса есть. Тогда проще собрать мРНК с раскладкой по экзонам in silico - через сравнение баз EST с геномными базами нукл. последовательностей. В итоге останется только верификация спорных мест и возможно 5' хвоста - они могут бытьь в базе представлены не полно. Хотя сегодня EST бызы очень избыточны ...
imers, 30.01.2002 08:55
Спасибо за ответ, во-первых smile.gif
1) Я тоже так и сделала - т.е RT c random а затем 40 (затем доставляла до 45) циклов PCR на кДНК со специфичными праймерами. Получился _очень_слабый_ сигнал, судя по размеру - с "остаточной" геномной ДНК. Подозреваю, что причина неудачи - в том, что у гена есть 3'UTR длиной не менее 4 килобаз, + сам ген - где-то 5,5 килобаз, и у меня кодирующая часть оторвалась от polyA при выделении (хотя в описании кита Promega написано, что он выделяет _нативную_ мРНК, но до какой длины она остается "нативной" - не написано.) Учитывая, что этой "незаконной" мРНК там и так немного - может, нужно как-то ПЦР усиливать, чтобы все же вытянуть то, что не деградировало?
А Вы нестед-праймеры не используете? И 1000 bp - это размер всей мРНК, или Вы такие фрагменты амплифицируете?
И из какого количества крови Вы выделяете мРНК (и сколько затем берете в RT и cDNA - в PCR?)
Может, я просто слишком мало клеток брала (выделяла из 200 мкл свежей крови, правда, осадок мРНК был очень хороший - этот Промеговский кит и правда дает очень хороший выход.) В RT брала всю (увы, количество определено только примерно, по таблице выхода той же Промеги - померить поглощение не на чем).
M-MVL ревертаза у нас отечественная (с такими желтенькими наклеечками, без названия производителя, концентрация 20 u/mkl). На мРНК коллагена из фибробластов - работает прекрасно.
2. Зачем это нужно?
Это у меня уже несколько другая задача. У нас есть семья, где есть сцепление с локусом, для которого ген вроде бы известен (но мутация в нем показана пока только в одной семье, причем маленькой). Лод в нашей семье - +3.55, т.е. сцепление с этим локусом доказано. Единственная уже известная мутация в исследуемом гене - миссенс, доминантная. Мы посмотрели в своей семье весь ген: на геномной ДНК, сиквенсом всех экзонов с прилегающими кусками интронов, сиквенс с двух сторон - и точковой мутации в известном гене не нашли.
Судя по полиморфизмам в 2-х экзонах - делеции всего гена тоже нет.
Теперь задача - либо найти делецию целого экзона (или нескольких), или доказать, что их (делеций) нет и спокойно исследовать новый ген-кандидат. Остается, правда, еще такой неприятный момент, как возможная мутация где-нибудь в промоторной или вовсе в регуляторной области... Но здесь уже ничего не поделаешь. Опять же, вероятность этого очень мала.
imers, 30.01.2002 09:52
Простите, соврала:
В RT брала не всю полученную мРНК, а только 1/10 - т.е. где-то 5-7 гамм. Мало? (Но, правда, это не тотальная РНК, а именно мРНК, по крайней мере процентов на 90, если, опять-таки, верить Promega. А судя по опытам с мРНК коллагена - верить ей можно smile.gif )
И выделяла я не совсем "из крови" - пробирка с кровью несколько часов стояла в холодильнике, и я старалась отобрать получившуюся "интерфазу", обогащенную лейкоцитами. Но ни на каких фиколлах и т.п. лейкоциты не очищала.
Кис, 30.01.2002 11:43
Не понял все-таки, из какого количества крови выделяли РНК. Из каого объема крови "пленочка" ?
Ген у нас большой, весь не амплифицируем - только кусками. Задача в общем-то сходная - посмотреть на характер нарушения сплайсинга при верифицированной мутации сплайсинга.
Амплификация - много короче, 33-35 циклов. Больше - начинает лезть неспецифика. 5-7 гамм РНК должно хватить за глаза.
Как я понимаю, вы хотите отамплифицировать весь транскрипт от конца до конца в норме и у больного - и в случае удачи найти уменьшение размера ампликона. Но если транскрипт 10 килобаз - то делецию одного экзона (особенно маленького) можно и не увидеть. Может все разбить на несколько ампликонов меньшего размера и смотреть по кусочкам ?
imers, 31.01.2002 07:11
Ага, так и хотим делать - по кусочкам, перекрывающимся.
Кстати, у меня сегодня прошла ПЦР с моей "кровавой" РНК (т.е. кДНК) с праймерами на коллаген (поставила для контроля, за 40 циклов - хорошая полоса. Коллаген в крови - надеюсь, можно считать за illegitimate ? smile.gif ). Так что проблема, видать, все же в праймерах и ПЦР, а не в РНК и RT, как я боялась ("а ларчик просто открывался..."). Теперь ясно, что делать и в каком направлении работать (проверю праймеры, у нас уже такое бывало, что вся партия плохая приходила).
Большое спасибо за практическую помощь и моральную поддержку!
moonlife447, 25.09.2022 12:24
F1 Renovations is one of the leading renovation companies all over the UK. We provide painting and decorating services, including all types of decoration like house renovation, kitchen renovation, bathroom renovation, tiling, flooring, etc. We provide quality service at cheap rates.

Removals Company | Removals Company | Office Removal in London | Office Removals London | Relocation Companies London | Removals Company in London | Moving Company in London | Moving Company | Movers in London | Man and Van in London | House Removals in London | House Removals | Packers and movers in London | Packers and movers London | Movers and Packers in London | Relocation Company in London | Commercial Removals | Local Movers | Long Distance Mover | Long Distance Movers | Long Distance Moving Company | renovations | london renovations | renovation companies in london | renovations company london | house renovation in london | Kitchen renovation london | Kitchen fitting london | Kitchen fitters in London | bathroom renovations london | painters and decorators in london | painting and decorating in london | painters in london | london decorators | vinyl tile flooring | vinyl flooring | laminate flooring | parquet flooring | wood flooring | parquet flooring london | luxury vinyl flooring | lvt flooring | wood flooring london | karndean flooring | herringbone flooring | laminate flooring london | amtico flooring | bathroom floor tiling | bathroom tiling | kitchen tiling | floor tiling | porcelain tiling | terrazzo tiling
Ufa1688, 27.09.2022 19:28
Yet in the days ahead 1688.comit will be tempting to dismiss ufabet เข้า สู่ระบบMoscow’s broadened claims ufabet168cof sovereignty and บอลสเต็บsaber-rattling as the dying แฮนดิแคปthroes of an empire ลิงค์รับทรัพย์that forgot to look under the hood UFA1688before it went driving in a storm. สล็อตออนไลน์This is a win or lose moment ราคาบอลfor Putin, and he does not see ufa1688a future in which he loses.
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.