Уважаемые коллеги!
Если кто-то выделяет мРНК китом Promega "PolyATtract® System 1000" (она тащит мРНК за polyA-хвост) - подскажите, какой длины мРНК удается выделять? В описании кита - только оценка количественного выхода. Опыт в нашей лаборатории показывает, что первые экзоны с мРНК длиной 4,5 килобазы еще амплифицируются. А 10 килобаз, интересно? Отрывается начало от polyA-хвоста в процессе выделения, или нет?
Понимаю, что этот способ выделения - в моем случае не лучший, но другого у под рукой пока нет (а вот лимфобласты уже ждут... .
И еще вопрос - если кто-то вытягивает "незаконную экспрессию" (illegitimate transcription) - какими (и чьими) китами Вы пользуетесь? И как: RT-PCR, или RT (со специфичного праймера? или с random?), а потом PCR? Если так (отдельно RT и PCR) - то какой фермент лучше брать для RT? (у нас есть M-MVL, но неизвестно чей, и совсем мало AMV, но Promega). Сколько циклов ПЦР Вы делаете, какова у Вас максимальная длина получаемого ПЦР-продукта?
Мне нужно вытащить (в виде пересекающихся ПЦР-фрагментов) мРНК нейронального белка общей длиной около 10 килобаз, причем в качестве источника РНК доступны только или свежая кровь, или лимфобласты.
Буду очень признательна за любые советы и помощь информацией!
(статьи уже читала, но прошу совета у тех, кто этим занимается здесь и сейчас).