Всем доброго дня

Помогите плс. методикой окраски живых клеток на пластике, для флуорисцентной микроскопии.
Можно ли использовать протокол протокол как для проточки ?
добавил краску в культуру, проинкубровал, отмыл и на микроскоп ?

Ну, коли ин-виво трейсер один и тот же- то и протокол для окрашивания идентичный.
Другое дело- что не факт, что под микроскопом будет видно хорошо. Впрочем, если "зеленка" типа кальцеина или CFSE- то все видно.

можно

Ну если можно, тогда след. вопрос
Например хочу проверить экспрессию клеток на CD133, 117 есть соответсвующие АТ с красителями FITC и PE
Клетки сидят на пластике... Как вести себя дальше ???
Можно ли так ?
1. Заменить среду на что нить без краителя типа PBS или подобное
2. Добавить CD133, 117
3. Инкуб-ть в темноте, затем 2-3 раза отмыть PBSом, и снова залить PBSом

Сразу вопросы:
1. PBS обязателен или можно оставить среду (если она не фонит)?
2. Сколько брать АНТИТЕЛ ??? (если в протоколе к проточнику 10мкл на 1 млн. таржет клеток, но в проточке обьем образца маленький, а конц. клеток высокая. На моем же протоколе обьем будет большим а концентрация клеток нормальной - приблизительно 5-7 мл - 5-6 млн.) Если взять 50 мкл АТ не будет ли разведение слишком большим для успешной метки ???

Еще огромная просьба, у кого есть, слить пару картинок с позитивными и негативными по свечению клетками ?! Заранее благодарен !

Тэкс, по пунктам.
1) если юзаете кальцеин или CFSE- то FITC-коньюгаты не подойдут ( ибо - спетры те же ). Придется в качестве трейсера юхать, например, Far-Red
2) Снимите клетки с пластика и юзайте стандартные протоколы для стейнинга + FACS ( ибо под микроскопом вы них... не увидите на фоне трейсера).
3) Главный пункт: зайдите вот сюда - и учите матчасть.

Удачи!

Спасибо за ссылку и ответ !
А теперь ..... уфсе сначала, но для чайника
что такое кальцеин и CFSE ? трейсер - это метка ???
И последнее снимать с пластика обязательно ? я хотел именно живые клетки покрасить и последить за ними...... если снимать клетки, тоя проще через проточник пропущу

Просто мне перепал новый микроскоп с люминисценткой.... теперь вот думаю что им можно делать ? Хочу пофоткать, сделать фильмец живых клеток, идентифицировать по экспрессии CD не снимая с пластика

Дык, после снятия с пластика они останутся живые. Да и процедуру мечения трейсерами "так как надо" вы в планшете провести не сможете нормально. Антителами- тем паче.
И, коли есть доступ к проточнику- зачем извращаться с микроскопом?

По меткам:
CFSE

Calcein

Far Red

P.S. А для лайв-имаджинга клетки надобно окрасить предварительно (согласно стандартным протоколам) а потом уже снова переместить в среду. Дать им рекавери часок -другой ( в темноте , в инкубаторе)- потом и снимать можно.

P.P.S. Микроскоп люминесцентный...хм...Сначала проверьте- на каких длинах волн там возбуждение идет и какой блок светофильтров на регистрации стоит.

Спасибо !
А где бы посмотреть протоколы для лайв-имаджинга ???

3 фильтра
возбужд / эмиссия
546 / 575-640
450-490 / 575-640
546 / 575-640

На том же сайте, что и инфа по меткам. Там же есть и spectra viewer plug-in, позволяющий поиграться с комбинациями меток.

И еще вот сюд зайдите:
http://www.cyto.purdue.edu

Коллеги, у меня вот такой вопрос: требуется окрасить бактерии с помощью live/dead красителя содеоржащего calcein-am и PI (Fluka). в мануале написано "развести концентраты в PBS" - имееется ли в виду буффер с нейтральным-слабощелочным pH ? и вообще насколько этот момент (молярность, рН буфера) важен в подобного рода манипуляциях ?