Народ, пожалуста, помогите!
Напишите кто-нибудь как строить графики Скетчарда. У меня есть белок (лиганд) меченный по тирозину иодом-125, есть рецептор. Ставлю связывание (инкубацию) лиганда (концентрация лиганда - 30, 50, 80 мкг/мл, т. е. добавляю лиганд с разной концентрацией) с рецептором - все это делается на живых клетках сидящих на чашках. Есть два типа чашек - контрольные (там практически нет рецептора) и опытные (со стабильно введенной плазмидой кодирующий наш рецептор - там типа оверэкспрессия). Готовлю лизаты. Отношу эти лизаты на счет. Получаю цифры (в имп/мин). Лизаты нормализую по белку (чтобы типа знать что количество клеток на чашках было одинаково). Что делать дальше с cpm (имп/мин). Как графики то получить?
Делается это все чтобы посмотреть увеличивается ли связывание лиганда с рецептором (по количеству меченного лиганда) в опытных чашках относительно контрольных. Если так будет то круто!
Вот вроде и все.

А как же у отца Дмитрия спросить, у них же куча статеек по этому вышла.
Ну а цифры изменяются, если счиот больше на трансфецированных чашках, то значит это круто.
У меня есть ссилки на англииском вот, хотя в инете есть источники и на русском. Почитаи-с.
http://www.graphpad.com/www/radiolig/radiolig1.htm

http://medicine.creighton.edu/pharmacology/Binding.htm

[Текст переведён с транслита]

1) для того, чтобы просто показать увеличение количества комплексов лиганд-рецептор вовсе необязательно строить графики Скэтчарда. Достаточно просто сравнить сигналы в насыщении контроля и опытного образца.
2)Правда в случае Скэтчарда вы заодно можете получить Kd (равновесную константу диссоциации). Если она окажется одинаковой, то вы тем самым подтвердите (не совсем прямо, но все же), что имеете то же самое взаимодействие, а разница лишь в количестве рецепторов на клетках (что по-видимому и есть ваша цель?)
3) График Скэтчарда - это всего лишь способ представления в линеаризованной форме (есть и другие представления) уравнения равновесия для моновалентного взаимодествия между лигандом и рецептором L+R<=>LR:
в равновесии Kd=[Le][Re]/[LRe] (*)
Для построения графика Скэтчарда вам надо знать равновесную концентрацию свободного лиганда Le, комплексов LRe. В этом случае
(*) можно записать в виде (с учетом, что [Re]=[R0]-[LRe]): Kd=[Le][R0-LRe]/[LRe] (**), что ведет к уравнению Скэтчарда:
[LRe]/[Le]=[R0]/Kd-[LRe]/Kd.
То есть надо отложить по оси Х [LRe], а по оси Y - [LRe]/[Le] или величины им пропорциональные (в вашем случае отсчеты cpm). Отрезок отсекаемый на ОY =[R0]/Kd (в вашем случае пропорционалн), наклон =-Kd (в вашем случае пропорционален).
4) если вы знаете только добавленную концентрацию лиганда, то надо в (**) подставить Le=L0-LRe...
5) ИМХО в нынешнее время необязтаельно строить линеаризованные графики, когда можно эффективно подгонять теоретические кривые с нужными парметрами к экспериментальным точкам...

Согласен с предыдущим оратором, стоит лишь добавить, что равновесная конц. лиганда вашего рецептора скорее всего практически равна добавленной, т.ч. можно и вовсе не заорачиваться!

2 Zlenko: скорее всего так, но вдруг они много клеток насыпали. Так что пусть проверят.

2 Прохожий: Zlenko прав - поскольку минимальная добавленная концетрация лиганда ОЧЕНЬ большая (30 мкг/мл), то она равна равновесной (Так много рецептора не бывает).

Но непонятно, почему такая узкая раститровка лиганда (30, 50, 80 мкг/мл)??? С таким же успехом можно и одну насыщающую концентрацию дать.
С уважением. Гость.

Спасибо большое Прохожему, ваша помощь незаменима