Здравствуйте коллеги!
Мы пытаемся разработать ПЦР метод обнаружения микоплазмы по следующей статье (смотрите закачку)

Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines
Uphoff, C.C., Drexler, H.G.
In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, Springer New York, vol. 38, no. 2, pp. 79-85

Праймеры уже есть , но нет внутреннего контроля и вот он вопрос, кто нибудь делал внутренний контроль? Как его делать? он нужен? и еще, люди добрые, можете поделиться микоплазмой или клетками зараженными микоплазмой для положительного контроля)
если кто нибудь уже пробовал этот метод, расскажите пожалуйста о подводных камнях... если это не секрет конечно!

i1543_706X_38_2_79.pdf размер: 547.94 кол-во скачиваний: 12 29.08.2007 — 12.09.2007

Так метод то уже давно разработан и используется для детекции микоплазм в клеточных культурах. Это давняя разработка НИИ Цитологии в Санкт Петербурге.

Наверное, я неправильно выразилась, просто пытаемся у нас в лаборатории использовать этот метод! и не совсем получается, дело упирается во внутренний контроль и положительный контроль... Было бы полезно пообщаться с человеком , кто разбирается)

Не могу сказать, мы покупаем в Питере клеточные культуры и они уже готовые проверенные на микоплазму.
НИИЦитологии есть авторское свидетельство на эту методику еще советских времен, в любом случае я не представляю микоплазм существует более 150 видов а как эта методика может охватить хотя бы 20 специфических видов понятия не имею. Но должен отметить, что клеточные культуры получаемые из Питера таки чистые и не контаминированные микоплазмой. Видимо они настроили методику на несколько видов микоплазм типа hominis;equis и др наиболее часто встречаемые. А вообще чем морочить себе голову ПЦР методикой проще сделать посев на полужидкий агар Хейфлика и если микоплазмы есть в клеточной суспензии или культуральной жидкости они в течение 7 дней наверняка вырастут.

Спасибо)

Внутренний контроль - это вторая ПЦР система (праймеры+матрица), работающая в той пробирке и показывающая на оптимальные условия протекания реакции. Иногда изготавливают матрицу, отличающуюся размером. составом и т д, но имеющая те же сайты отжига что и данная пара праймеров (в Вашем случае на Myc. sp.). Такие вн. контроли называются конкурентными (компетиторными) и применяют для количественной оценки матрицы. Хотя любой внутренний контроль оказывает конкуренцию основной реакции и это надо помнить всегда.
Может стоит поискать другую статью про внутренний контроль, и делать все как "у них" и будет на кого сваливать. Ничего Вы не "разрабатываете", будьте поскромнее! Извините.
ЗЫ Когда эти праймеры будут обнаруживать микоплазму везде, даже в воздухе, Вас ждет другой уровень повышения квалификации. А пока...

покрасте клетки ДАПИ и посмотрите в микроскоп - микоплазма будет светится на клетках- чистые клетки - токма ядро

а если просто купить а не разрабатывать
http://www.promokine.de/index.php?id=23

вашим набором вы будете тестировать Так ПОЛИМЕРАЗЫ , БСА, ХОТСТАРТ АНТИТЕЛА
и прочие КОМПОНЕНТЫ ПЦР МИКСА на МИКОПЛАЗМЫ - до клеток дело не дойдет

Здравствуйте гость! а почему мы будем тестить все перечисленное? спасибо за ссылку)

To Kucha:

Тестировала наша постдочка клетки на микоплазму ПЦРом (не знаю, не биг фан ПЦРных игр, по-моему, она юзала какой-то коммерчески эвейлэбэл кит, базирующийся на ПЦР). Всё было чистенько.
Я тупо-вяло красил клетки на нужные мне антигены, ну и один раз ДАПИ докрасил. Картинка получилась жуткая: все в микоплазме. Мне никто не поверил, мол ПЦР не перешибешь! Проверили повторно ПЦРом - и правда микоплазма, ясно?

Так что не заморачивайтесь с ПЦРами, праймерами, внутренними контролями и т.д. и т.п. ДАПИ покрасить, в микроскоп глянуть - и то-та дело рОдное

если применяя ДАПИ+микроскоп вы не увидели там микоплазмы, она там еще очень даже может быть. При ПЦР со всеми контролями вероятность проглядеть ее меньше

Не согласен! Это не типичный случай. Проблема всегда в обратном - ПЦР (особенно самопалные киты "по статьям") обнаруживает микоплазму везде, даже в воде. Главная причина этого - неспецифические праймеры, дающие перекрестные реакции со многими 16S, в том числе E.coli.

ну так это недостаток конкретных праймеров, а не метода. Мы периодически проверяем клетки (покупной системой), и в отр.контроле всегда всё чисто (а полоска внутреннего контроля даёт уверенность в нормальном прохождении реакции).

Спасибо всем...

Не изобретайте велосипед, Анна! Для начала покупайте готовый и катайтесь на здоровье.

а дапи надежней

С ДАПИ трудно напортачить - а с ПЦРом нагородить и ложно-отрицательных
и ложно-положительных - без проблем - даже сильно старатся не надо

Makenna