Уважаемые коллеги! Пожалуйста, помогите разобраться и внести ясность...
Пытаюсь найти оптимальную методику выделения МСК из костного мозга. Нашла кучу протоколов... При этом вопросов у меня тоже не мало
Выдление МСК :
1. выделение мононуклеарных клеток на фиколле;( 1100g 30 мин, 350g 30 мин )
2. отмывка клеток в PBS, Хэнксе;
3. ресуспендирование клеток в пит. среде
4. "посев" клеток на матрасы с плотностью 1-2*105 кл/см2
5. смена среды через 3 дня. Всё, что прикрепилось - МСК. Со средой удаляем ГСК
Далее культивируем как фибробласты...
Вопросы:
1. оптимальная скорость и время центрифугировани... Разброс очень большой...
2. МСК находятся в интерфазе с гемопоэтическими клетками?
3. плотность посева.. имеется в виду ГСК+МСК?
4. Среда DMEM-F12 с глутамином, 20 % ЭТС, bFGF подойдёт?

1-2. Используйте RBS Lysis Solution вместо фикола. Все что нужно - добавить и подержать на льду.
3. Ну вы же не можете определить кто есть кто на глаз, естественно общее количество клеток.

2. в интерфазе дохрена чего будет - с десяток различных клеточных популяций -
да в том числе ГСК + МСК - до 1%

вы сначала разберитесь что вы будете называть МСК, а потом уже и протокол
а что это такое давно обсуждалось на форуме - пользуйтесь

Под МСК подразумеваю не гемопоэтические клетки, прикрепляющиеся к пластику. Всё, что останется после первой смены среды.
RBS Lysis Solution к сожалению нет.
А перед центрифугированием на фиколле нужно КМ разбавлять? Хэнксом или РBS.

вы не правы! это смесь нескольких клеточных популяций, читайте дефиниции МСК на этом форуме и больше статей

сделайте сами - рецептура на этом форуме была

конечно! 1:5 или даже 1:10

Cells-nnm, спасибо огромное. Буду искать!

http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=115578
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=112105
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=112423
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=112171

Уважаемые коллеги! При выделении "прикрепляющихся к пластику" клеток из костного мозга столкнулась с проблемкой... При смене среды через 3 дня в флаконе много жирных капель как от них избавиться? и вообще, от куда они?
И ещё... Видела протокольчики в которых не нужно разделять на градиенте плотность. Сеят костный мозг со средой... Через 3 дня - как обычно...
Что думаете по этому поводу

не важно каким из 1001 предложенных методов вы выделяете ММСК,
важен конечный результат - 99% клеток в вашей культуре соответсвует критериям ММСК (флоу-характеристика, функциональные тесты, дифференцировка), описанным группой мировых экспертов
http://molbiol.ru/forums/index.php?showtopic=115578

протестите ваши клетки и всё, в чём проблема то?

Cells-nnm , ещё не получила культуру. Недавно только выделила.
А что с капельками жировыми делать? Откуда они

Подскажите, плиииз, зачем нужна аскорбиновая кислота в среде для ССК?
И, вообще, каким образом она влияет на клеточную культуру?

Подскажите, пожалуйста, как спассировать мск если образовался плотный монослой... У меня получаются "куски пласта" ... а нужна клеточная суспензия
Использую раствор трипсин-Версен 1:5. Если монослой не слишком плотный - проблем не возникает.....

Сначала промываете 2 раза версеном, потом заливаете небольшим количеством трипсина. И не стоит доводить до плотного монослоя, рассевайте при 80-90% конфлуентности.