Здравствуйте, у меня вопрос такой будет. Есть ситуация - клетки с GFP. Надо померить уровень флюоресценции в популяции. Если просто считать FL1, то флюоресценция отличается, в зависимости от размера клетки, т.е. большие клетки светятся больше, а маленькие, соответственно, меньше. Читал о методе, когда флюоресценцию считают в пределах очень маленького гейта по FSC/SSC, чтобы минимизировать влияние размера и гранулярности клеток. А вот если надо все-таки померить всю популяцию, то есть ли какая-нибудь простая поправка или коэффициент, чтобы нормализировать флюоресценцию относительно размера клеток?

У кого-нибудь есть предложения?

Спасибо заранее.

Собственно, в чем проблемы?
Открываете 2D-дотплот по FSC-SSC. Рисуете там гейт в нужном месте, потом открываете 1D гистограмму по FL-1, привязанную к этому гейту ( в зависимости от софта либо автоматически линкуется, либо нужно в опциях диаграммы галочку поставить). Далее расставляете маркеры- и смотрите статистику, MFI, пики=- все, что душе у годно - как раз в пределах выбранной по параметрам светорассеяния.

А по нормализации флуоресценции по объему клеток либо по размерам- это потом, софтинкой.
Или узким гейтом пробежаться вдоль - а потом данные слинковать.

Имеется ввиду именно после прочтения данных, когда они уже записаны на диск. Узким гейтом пробежаться вдоль - не подходит в нашем случае. Надо именно всю популяцию (довольно большую по FSC/SSC) и сразу. Поэтому и спрашиваю про поправку если она есть.

Единый пересчетный коэффициент для всех клеток?
Ну, в принципе, можно прикинуть оценочную флормулу, связывающую через скаттер-параметры размер клетки и число флуоресцентных молекул в ней. Но тут одна сложность: в клетках одинакового размера может быть разное количество флуоресцентного репортера, в Вашем случае- GFP.
Так что без гейт-скана не обойтись.

Вот это то нам как раз и нужно - оценить средний разброс количества GFP по клеткам в популяции, учитывая коррекцию по FSC i SSC. Т.е. нечто вроде средней концентрации, причем, конечно, не в абсолютных величинах, а скорее в условных единицах, чтобы можно было разные популяции сравнивать. Поэтому и спрашиваю, делал ли кто-нибудь уже нечто подобное. Наверняка, идея довольно простая, только вот нигде не могу найти ничего внятного по этому поводу.

Нее, без "нарезки" тут не обойтись.
В принципе, можно смотреть только по FSC, ибо SSC определеятся не размером клеток в основном, а гранулярностью. А дальше - формулы для рассеяния в зависимости от диаметра частицы и т.п.
Но опять таки: клетка меньшего размера может содержать больше молекул флуорофора, нежели более крупная.

P.S. А с чего заморочки то по морфологии? Какой смысл? Как известно, у клеток даже одного типа ( например у T-клеток с одним репертуаром TCR) скаттер параметры весьма вариабельны.
Может просто еще по поверхностым маркерам покрасить, дабы вычленить узкий сабсет без извратов?

На нашем CellLabQuanta прямо есть галочки: флуоресценции на единицу поверхности и на единицу объема. В нем также можно сделать по оси отношение двух параметров. А так ведь можно сделать дотплот FSC против FL1 и на нем должна быть видна картина происходящего.

Верно.
А еще лучше - FL-1-A vs FSC-W