очень большие проблемы. все поменяли. абсолютно. все заказали новое. все реактивы, пробирки, воду. раз работает, другой раз не работает. независимо от того - кто делает, когда делает и вообще. до этого работало 2 года без единого сбоя. и так уже 3 месяца. если не решим порблему, то будет совсем плохо, врачи и больные ждать не могут(((а у меня дети.

Че в качестве контроля пользуешь? Он тоже не работает?

мы положительным контролем не пользовались, там свои нюансы, д ау нас 2 года все работало как часы. после всех событий, 2 недели назад у меня случайно все получилось, я оставила 1- ПЦР_продукт как контроль. 3 дня назад Фредерик сделал образцы - все пролетело. вчера я сделалa, использовала те же реактивы, те же праймеры, взяла для контроля ПЦР-продукт - половина не прошла, вторая половина - отвратительн - слабый бенд, млечный путь, и контроль, котрый был идеален - ok

Ампилификатор нае..нулся?

не, он, ПЦР, работает через 5 раз на 6-й, а мы уже вызывали техника, все проверил - все Ок.

К нас такие приколы бывали, не поверите, из-за некоторых типов пробирок, причем супер-пупер для ПЦР. Устранялось их кипячением в дистилляте и сушке.
Самплеры надеюсь нормальные? Смесь раскапывается из мастермикса или растворяются биды?

Амплификатор - постарайтесь проанализировать часом не в одних и тех же лунках не идет реакция.

Ну, если контроль работает нормально, то может че при выделении образцов глючит? Из чего ДНКу гоните, и чем выделяете? Какчество ДНКи после выделения проверяете? И вообще ее наличие? У меня как то студентка пыталась ПЦРить с почти чистой воды, настолько была уверена, что процесс выделения ДНКи - процедура примитивная и испортить ее ничем нельзя. Попробуй проверить самые дурацкие из возможных причин, часто ответ именно в них находится.

ребята, без пнятия, мы уже и пробирки емняли, дайте переварю вопорсы, но позже, только что Сама Минибосса получила [очередной bullshit:((]а она вообще биолог от Б-га, я не преувеличиваю(

музыку в лаборатории выключите, когда капаете.

да мы уже все проверили, что можно...сперва решили, что я впала в транс и чего нафуячила..я бы и рада была, если бы это был мой фактор, то разобрались бы((а потом стало одинаково сыпаться у всех...поменяли все. каждый свои праймеры сам пользует. потом стали брать праймеры у кого работали - хрен. сегодня работает, завтра нет. не было у нас такого. процесс такой - выделяем РНК Того Самого Вируса. берем плазму только с известной [virus load],с низкой VL не берем. выделяем РНК. пОтом РТ-ПЦР, его проверить нельзя, в смысле - на геле недостоверная картина, поэтому переходим ко втоорму ПЦРу, и вот его результаты уже видны на геле((где что может валиться - у меня только Лунный камень уилки Коллинза в голове...только дело это затянулось((голов нам не сносить, если не раберемся в чем дело(музыку мы никогда не слухаем в лабе, и никому не пoзволяем. Более того, если кто сидит и работает в процессе - запретили друг другу даже подходить, чтобы чего не вышло(

есть какая-то систематическая ошибка, но пока не пойму какая..

да мы сами не понимаем - почему оно работает через два раза на третий((только так жить нельзя. уже и записываем все лоты, все ингредиенты - я раньше это все делала не глядя, не было у нас такого, это конвейер...а на моей голове еще вагон всего, а я последние два месяца только выделяю и ПЦРю(хоть бери видеокамеру и снимай каждый шаг(минибосса вообще ушла шатаясь в 3 часа дня, нервы не выдержали(( говорю, что она - Биолог с золотыми руками((

Оль, стопудово, вам нужно сделать внутренний положительный (а возможно и отрицательный) контроль. Я не скажу какой именно - зависит от ваших адач. Но, чтобы процесс был схожим..

Обратную транскриптазу не меняли перед тем как все начало сыпаться? Ставили контроль с какой-нибудь другой?

Может выставите последовательности праймеров , чем разговоры разговаривать

Машинку термометром проверьте.

http://www.fermentas.com/catalog/kits/kittranscriptaid.htm

Купите Инвитрогеновскую Суперскрипт-3
http://www.clinchem.org/cgi/reprint/50/9/1678

ревертаза, да - важный фермент. Но, Оль, имей ввиду, что вич-1 в своем цикле размножения проходит стадию ДНК, поэтому его можно выписиарить и без RT. Я так и делал, когда нужно было.
я не знаю, какой у вас протокол - ты кинь, мы устроим ему проверку..
напиши вкратце, что вы делаете. типа:
1-
2-
3-
4- смотрим 250bp продукт на форезе

Значит жЫзненная история.

Все сознательное существование по-тупому клонировал продукты ПЦР в TOPO TA, и тут вдруг на плашках стала тьма колоний, вставка левая и т.п. ВСЁ обновили, включая кривые руки. Грешили на всё на что только можно.

Оказалось что мега-Invitrogen выпустил огромную партию убитых этих TOPO TA с уже лигированными векторами. Причем выпустил не пару коробочек, а такую огромную партию, что 4 посылки из Invitrogena с заменой ничего не изменили. Кончилось их глубокими извинениями.

Я к тому что обязательно прогоните рекцию с левым набором всех реагентов. Например от другого производителя. И с новыми реагентами у соседей в лабе на их надежной машинке.

Мы вот три недели потеряли из-за щепетильных поисков.

Ну могу добавить , что Инвитрогеновский специальный "СИБР Гринер" для
реал-тайм ПЦР хуже ЕваГрин от Биотиум .
Ну и какие из этого выводы про Суперскрипт-3 ?

только ее и юзаем(((

счас будем осмысливать

Склонируйте кусок и Т7-ой наделайте вашей РНК для позитивного контроля

а зачем они нужны? два года работали, и епрестали работать вдруг?
сейчас коллеги из ЧУМа вышлют свой кит с обратной транскриптазой(

Да так газком взглянуть на уровень "канадских молекулярных патологоанатомов"

ребята, у нас в данном случае конвейер, который дал сбой. методика отлаженная, отработанная и не нами, и работа;а 2 года, и работает в других лабах. имеет место какая-то внутренняя порблема(

уровень полный порядок, но я не имею права протоколы давать, мне мое место доорго

Для РНКовых вирусов лучше иметь три пары праймеров разненьких -
как говорят лучше перебдеть , чем недобдеть

да уж такие "протоколы" лучше людям не показывать

При проблемах, описанных автовом практически однозначный ответ - реактивы, и скорее всего буфер, а именно его концентрация (и соответственно йонная сила).

Закажите реактивы в другой фирме, возьмите буфер из старых запасов

И отсутствие надежного положительного конроля не слишком хорошо характеризует лабу. Не настолько уж РНК нетабильна, что ее нельзя номально хранить.

согласна, нечего возразить, когда раньше секвенировали [bayer], был контроль, а потом перестали, только что с минобоссой имела беседу))перестали....сейчас, ес-но, возьму готовый +++контроль из старых запасов от [Bayer]...

Ольга, а вообще сильно-то не переживай . Ну, даже рискнут ( !) выгнать , поедешь в одну теплую, хорошую страну...
А они пусть сидят в холоде и ищут дураков на такую работу

Удачи!

мерси, найдут без проблем, я заних ен боюсь...устала. завтра получим кит от соседей из ЧУМа, возьмем образцы, коотрые были негативными, и поргоним еще раз...это будет мой последний и решительный бой...

Еще такой вопросец. У вас было такое, что с одних и тех же образцов РНК вчера ПЦРилось со свистом, а сегодня - нифига на постном масле? Или каждый раз пользуете новые образцы и реакция то идет, то нет? Проверьте все же процедуру на стадии приготовления образцов РНК. ПЦР и даже РТ-ПЦК - не бог весть какая сложная реакция, испортить там че то сложновато будет. Хотя и возможно. Еще вопросы. РНКу выделяете тотальную? Тогда запузырьте в качестве контроля амплификацию любого кондового гена, то есть РНКи с него. Можете для контроля этого контроля ПЦРить и с плазмиды с кДНК этого же гена. Такая реакция не может не идти. Тогда поймете точно где прокол. На стадии реакции или на стадии подготовки образцов.

счас осмыслю. счас расскажу, что завтра буду делать, а тогда, наверное, придется и на это извращение пойти((
у меня поток - я сиквенирую [HIV] для госпиталей, т.е. я пролетарий от пробирки, ну, и наука тоже не чжда, но в основном - у меня поотк((образцы идут нон-стоп. почему не использовали ++контроли - именно потому, что все уже давно отлажено...и если [viral load] выше определенного предела, то работает все 90%, в моих ручках и до 95%, ес-но, бывали негативные при нормальной [viral load], но очень мало. а теперь пошла чертовщина - влятся ПЦРы((или проходит половина образцов, а вторая, с нормальной [viral load] - нет...а 50% нам не подходит, у нас 95-97%((одни и те же образцы РНК (да, тотальной) никогда не делали - опотому как нет смысла, мне поргнать надо, результат получить, отчет доктору послать, и науку делать((а раз такое дело, то завтра возьму все, что можно: РНК, которая несколько раз не поршла ПЦР (с нормальной [viral load]), РН,К которая давала отличный ПЦР, готовый +++контроль от [Bayer], возьму наши инвитрогеновские киты, и возьму кит, который ЧУМовые коллеги пришлют(((послезавтра будем смотреть((что нафуячить на стадии выделения РНК можно - не знаем, ведь 3 человека (включая меня) с очень высокой квалификацией (включая меня)) получают херню(((

вот это сейчас минибосса и старается инвитрогеновцам втолковать, они требуют доказательств...значица, завтра будем добывать доказательства(

Возбми образцы, которые железно работали и те, с которых реакция не прошла. Прогони еще пару раз. Если результат будет тот же, то проблема в образцах, а не в реакции. Если будет разнобой, то виновата реакция. Ищите причину, где портачит. Другого выхода не вижу.

Просто мы лажали нашу мега-технишенку которая делала компетентные клетки. Что у неее, типа, руки кривые. Потом себя, что убили антибиотик, потом Высшие силы... кто ж мог заподозрить, что поставщики могут такую лажу спороть.

Причем, первые два раза они безропотно присылали коробочки с заменой вектора. И только после наглядных детских пособий "вот со старым вектором нормально, а с ново-присланным полная лажа" нам прислали делегацию менеджеров, которая заявила что "в жизни такого не видела, но против фактов не попрешь".

Я к тому, что и такой фактор надо учитывать. Что даже динозавры биотеха могут прокисшее прислать в красивой коробочке.

НЕльзя исключить и внешний неконтролируемый апериодический фактор - например, появление вблизи электромагнитных излучателей, затрагивающих ПЦР. А также флуктуации магнитного поля Земли. Не забудем также и про безматричные синтезы РНК и ДНК ку бета репликазой и термофильной ДНК полимеразой. Эти синтезы вообще полная хе...я с точки зрения здравого смысла. Хотя, возможно, запускаются не без участия внешних полей.

Не знаю как там насчет полей - но "безматричный" , который ессесно палиндромоматричный , синтез зависит и от пробирок -
проверял неоднократно Может "голографическая"
контаминация ПЦР пробирок фантомной ДНК у разных фирм разная ?

НЕт, ку бета репликазный синтез РНК (6S) РНК - не палиндромоматричный.

А термофильная ДНК полимераза действительно на вторых и третьих и т.д. этапах палиндромоматричная. Но на исходном 1-м этапе ДНК матрицы НЕТ, а короткий полимер тем не менее синтезируется и только потом многократно "палиндромируется", будучи сам себе "складной" матрицей.

Матрица есть всегда - не видел ни одной чистой полимеразы .
Возьмите панбактериальные праймеры и отпцрте свои мифическичистые полимеразы.

так...
похоже грядёт Анал№2

да, Той Самый Анал 2 уже пришел.

Есть много фундаментальных работ по ку бета репликазе, в т.ч. с участием нобелиата Эйгена. В нескольких специально проверяли чистоту систем. И главное, без матрицы лаг-период около 8 часов, только после этого начинается синтез. С матрицей, в т.ч. контаминозной, синтез начинается с первых минут.

Насчет ДНК полимеразы не знаю, работ по специальной очистке не видел. Но для контаминозной ДНК эта матрица подозрительно мала - 5-6 н.п., судя по исходной работе японцев.

если контролей нет и нет картинок анализов - тут говорить неочем.

ППГ поблагодарил, что он уже свою теорию пытается привинтить к ПЦРу. Это весьма смело с его стороны.

счас буду ставить Мега эксперимент, со всеми контролями и прочим.
пусть ППГ лазером посветит...

Лучше проверьте наличие новых излучателей вблизи лабы. Насчет геомагнитных бурь тоже поинтересуйтесь.

Петр Петрович, ну не лезьте туда, где ни в зуб ногой

P.S. Впрочем- вы везде так...Как в анекдоте: "...Дети у вас -замечательные. А вот все, что вы делаете руками и головой- полная дрянь"(С)