Полная версия страницы  English  

Как сделать липкие концы - тупыми?

HACTEHKA, 18.07.2008 13:22
Нужно сделать липкие концы тупыми.
И какими ДНК полимеразами I лучше их надстраивать до тупых?
guest: Андрей , 18.07.2008 14:07
А Кленов вас чем не устраивает?
Egil, 18.07.2008 14:17
Возьмите PFU полимеразу. 30 минут на 72.
Guest, 18.07.2008 14:41
Их можно либо "достроить" , либо "подрезать". А что вам нужно? Если "достроить - то ДНК-полимеразой - вам коллеги уже присоветовали. Если подрезать - воспользуйтесь нуклеазой Р1 или S1. Все зависит от вашей задачи.
Guest, 24.07.2008 19:56
Дорогой гость, Вы большой теоретик! Если о предмете Вам известно только из книг, пожалуйста воздержитесь от комменсов frown.gif.
Андрей +1
Egil, согласен, для ПЦР продукта достаточно и 5 мин.
Guest, 24.07.2008 23:27
Все тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят...., хотел сказать, что
вопрос про липкие концы и причем тут ПЦР продукт... confused.gif
The problem, 24.07.2008 23:51
все просто, это написано в любом аппендиксе каталога NEB. Если достроить после рестрикции 5'- выступающий- берете Кленов, если съесть 3'-выступающий (достроить нельзя)- то Т4-полимераза. никаких S1 и прочего говна, они Вам такого наворотят. Тупить надо при комнатной темп., буквально 3, много 5 мин, не больше, ибо всякие простройки ников дадут Вам такую "мохнатую" матрицу, что будут проблемы при клонировании. Добавляете букв как в ПЦР, это с избытком, но их не жалко, 1 мкл фермента, 3 мин, и сразу в фенол. В любом рестриктном буфере, условия, понятно, субоптимальные, но надо-то всего 2-4 буквы достроить/съесть, это не big deal
Guest, 07.08.2008 10:48
Помогите достроить липкие концы pfu, сколько чего и какие условия необходимы? mol.gif
Большое спасибо за помощь cool.gif
The problem, 07.08.2008 12:37
не надо Pfu, просто добавьте в ПЦр Т4-пол, как я писал выше (букв можно немного добавить) 1-2 ед на 50 мкл реакции, 5 мин на столе, и все. Для Pfu по классике требуется добавить свой буфер, буквы и фермент, потом 30 мин на 70оС (так написано у Stratagene, по крайней мере, в ките для лигирования с помощью Srf I по тупым концам- что естественно, фирма предлагает свои полимеразу и рестриктазу)
Guest, 07.08.2008 12:53
(The problem @ 07.08.2008 11:37)
Ссылка на исходное сообщение  не надо Pfu, просто добавьте в ПЦр Т4-пол, как я писал выше (букв можно немного добавить) 1-2 ед на 50 мкл реакции, 5 мин на столе, и все. Для Pfu по классике требуется добавить свой буфер, буквы и фермент, потом 30 мин на 70оС (так написано у Stratagene, по крайней мере, в ките для лигирования с помощью Srf I по тупым концам- что естественно, фирма предлагает свои полимеразу и рестриктазу)

С Pfu тупить, я думаю, надо уметь - был случай у меня когда Pfu cо свистом объедал 3-конец и делал 5-торчащий липкий. Также Pfu портил мне зашпиленные праймеры (тупой конец). Т4 ДНК полимераза yes.gif и не открывайте америку. Проблемник прав.
Guest, 08.08.2008 11:30
поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?
Guest, 08.08.2008 12:45
(Guest @ 08.08.2008 10:30)
Ссылка на исходное сообщение  поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?

Надосадок (супернатант) переносите в чистую пробирку для осаждения спиртом, а фенол остается в пробирке, которую закрывете и в мусор.
Может быть порежется без очистки, попробуйте... confused.gif
The problem, 09.08.2008 20:10
фенол-хлороформ, разумеется? Непременно переосадить с добавлением соли, как обычно. Следы фенола- не гууд
Guest, 09.08.2008 20:36
(Guest @ 08.08.2008 10:30)
Ссылка на исходное сообщение  поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?


Я после 5ти минут на столе (Т4 полимераза с буквами) просто ставлю 20 минут на +70С, потом в лед, и добавляю вторую рестриктазу, без фенола.
The problem, 10.08.2008 13:06
ОК, так тоже хорошо, но не дай бог, не все умрет...К тому же, за 20 мин я 2 раза отфенолить успею- посему, быстрее очистить, чем судьбу искушать.
HACTEHKA, 20.01.2009 14:42
Нужно сделать из 5' - концов тупые путем обрезания нуклеазой S1 (надстроить не получиться, так как нарушится рамка считывания).
Подскажите, пожалуйста, как подобрать оптимальные условия для S1, что бы она не съела лишнее?
RJ Dio, 20.01.2009 16:38
я бы не стал упражняться с S1, много клонов лопатить придется, пока найдете один с нужной рамкой, лучше подумайте над изменением схемы клонирования, почти всегда можно найти что-нибудь поизящнее, чем S1
Odysseus, 11.02.2009 20:44
Можно ли использовать PFU полимеразу для получения тупых концов, если требуется переклонировать фрагмент длиной 2700 в вектор длинной 11000. При этом необходимо сделать тупыми липкие концы как у вставки, так и у вектора. Вектор для трансформации растений. Сбоя рамки быть не может, т.к. клонируемый фрагмент предназначен для подавления экспрессии гена по механизму РНК интерференции.


Проще говоря, возможны ли проблемы при дальнейшей работе с полученным вектором из-за обработки PFU полимеразой? (А то меня тут пугают smile.gif)

P.S. Других ферментов у меня просто нет frown.gif .

Заранее спасибо за ответ.
ship, 11.02.2009 22:18
2700 в 11000 вектор втупую вы можете клонировать лет эдак 10)))
Odysseus, 12.02.2009 13:59
(ship @ 11.02.2009 22:18)
Ссылка на исходное сообщение  2700  в 11000 вектор втупую вы можете клонировать лет эдак 10)))


Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. smile.gif
Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую.
Veshka, 12.02.2009 15:53
Зиллион годных универсальных способов, т-4ка, стрэндаза итэпэ, я обычно использую сие вкупе с кленовым щоб не отжирало лишнее. Можно немного потитровать...
RJ Dio, 12.02.2009 18:51
klenov лишнего не сожрет в присутствии букв, пустые страхи. Да и Т4 тоже, все же это полимераза на минуточку, а не екзонуклеаза
RJ Dio, 12.02.2009 18:53
(Odysseus @ 12.02.2009 13:59)
Ссылка на исходное сообщение  Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. smile.gif
Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую.

так не выйдет- нарисуйте, подумайте, поймете (может) почему.
Veshka, 13.02.2009 16:45
КленОв не жрёт 5' оверхэнги - ему нечем. А т-4ка это такая странная штука и жрёт чо ни попадя когда не надо. Потому иё сдерживать надо. Ядерным сдерживателем lol.gif
Odysseus, 13.02.2009 21:13
(RJ Dio @ 12.02.2009 18:53)
Ссылка на исходное сообщение  так не выйдет- нарисуйте, подумайте, поймете (может) почему.

Да, вижу. Видимо, не покатит. Спасибо. Буду думать дальше до понедельника. Уж больно не хочется делать два последовательных клонирования. smile.gif
бобр, 14.03.2011 16:55
А можно вместо т4 полимеразы использовать так эс е? вроде тоже 3'-5' экзонуклеазной активностью обладает, тэ-4 просто нету
RJ Dio, 15.03.2011 10:57
Taq юзать можно, Стратаген так и предлагает в своих китах по тупому лигированию с Srf I. Однако мне кажется это менее технологичным, нежели мезофильную Т4 использовать. Аккуратнее выходит. Кстати, особых страстей при работе с Т4 не наблюдаю. Надо просто 2-3 мин, на столе и в присутствии буковок, чтоб не сожрала чё ни попадя. Главное- не передерживать и сразу убирать после реакции. 2 мин- и на колонку. Будет счастье определенно. Много раз секвенировал места стыка, полученные именно таким путем- все Ок, буква в букву
katarina, 27.11.2011 20:15
(RJ Dio @ 20.01.2009 17:38)
Ссылка на исходное сообщение  я бы не стал упражняться с S1, много клонов лопатить придется, пока найдете один с нужной рамкой, лучше подумайте над изменением схемы клонирования, почти всегда можно найти что-нибудь поизящнее, чем S1

А Т4 полимераза не сможет 5-выступающий отгрызть?
RJ Dio, 28.11.2011 14:37
c 5' никто не работает, кроме киназы, пора азы науки знать
guest: Madyson , 17.05.2022 22:32
Madyson
nigoal123, 18.05.2022 09:26
As with all writing บาคาร่าออนไลน์ the language should be slot xo suitable for the audience. 11hilo the language will need to be สล็อต While each has specific 123GOAL easy for that age group to understand

but also exciting and lively nigoal enough to make them ลิงค์รับทรัพย์ common characteristics. พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง want to read it. ราคา บอล Each section has a heading Hotgraph that outlines the main topic
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.
Invision Power Board © 2001-2024 Invision Power Services, Inc.