Доброго времени суток.

Задача - поделить кровь на отдельные фракции клеток.
Минимум - выделить лейкоциты (суммарную фракцию).
Максимум - поделить на фракции и их, + получить чистые тромбоциты и эритроциты (это я так понимаю обязательно или градиент фиколл или с магнитными шариками).
Если методика используется в клинике - вообще шикарно.
Цель - определение активности фермента в лизате клеток.

Нашел на форуме
" 1.Забор крови с антикоагулянтом.
(можно использовать готовые Вакутайнеры с антикоагулянтом, но у них Объем около 7-8 мл крови, если Вам хватит... - это дороже. но удобней и быстрей.)
2. Добавление желатины аптечной на "глаз" 1:4 или 1:3 или 1:2, для усиления аггрегации эритроцитов
(Желатину можно заменить...., но это дорого)
3. Отстаивание при комнатной темп. до осаждения эритроцитов - 1-2- 3 часа.
4. Сбор плазмы с лейкоцитами, над осевшими эритроцитами.
5. Отмывка раствором Хэнкса без Са и Мg центрифугированием 3 раза.
6.После 3-й отмывки. ресуспендируете в в рабочей среде - Хенкс полный, Забуференный физ-раствор, среда 199 (если она не мешает Вашей ТХС). Подсчитываете концентрацию и вперед и спесней на ТСХ.

В этой клеточной суспензии будет много лимфоцитов кроме лейкоцитов, поэтому если Вам нужны высокоочищенные лейкоциты, хорошо бы эту суспезию прогнать через фиколл-уротраст (фиколл-пак) d=1.077, лимфоциты останутся на интерфазе, а лейкоциты "упадут" ниже -Вы их соберете и опять вперед и с песней. "

1. Какой антикоагулянт лучше если потом биохимия - наверно цитрат?
2. Желатину советуют заменить декстраном - какой декстран?
Есть некий декстрансульфат 500, натриевая соль - пойдет?
Или нужен Декстран 40 [ср. мол.масса 35000-45000] раствор для инфузий, раствор для инфузий [в растворе натрия хлорида 0.9%]
Или еще какой?
Какой концентрации раствор и сколько добавлять?
3. При какой температуре оставлять садиться? Можно ли то же за пару минут на низких оборотах центрифуги сделать?
4. При отстаивании как определить, что эритроциты уже сели? Другие типы клеток тоже ведь частично садятся? Если да то какая их часть примерно?
5.Где в этой методике оказываются тромбоциты?

С ув., Дмитрий.