Уважаемые коллеги,

возник такой вопрос.. Есть желание смотреть на индукцию апоптоза после трансфекции. (апоптоз предположительно вызывается транфецированным геном). Эффективность трансфекции - процентов 40 в лучшем случае.

Смотреть предполагается ФАКСом - PI или Hoescht 33342. В то же время, хочется смотреть только на клетки, экспрессирующие белок... Поэтому было бы неплохо одновременно красить антиген и ДНК.
Собственно вопрос заключается в следующем - все протоколы которые я встречал анализируют только распределение клеточного цикла, а не sub-G1.. Кроме этого, антиген как правило подбирается мембранный и красится fitc-conjugated антителами..
У меня антиген цитоплазматический или в ядре, и красить я собираюсь непрямым методом.
Есть ли смысл пытаться делать такое двойное окрашивание чтобы смотреть на апоптоз?
Есть ли смысл попробовать сделать double transfection c каким-нибудь поверхностным маркером и красить его напрямую?

Если у кого-нибудь есть опыт с подобными штуками, буду безмерно благодарен за совет!

Я думаю, вам при таком раскладе, вообще не удасть покрасить что-либо АТ в цитоплазме.

И опять, я думаю, что вам бы помогла фьюжн конструкция(для трансформации) с флуоресцентным белком и вашим фактором апоптоза.

40% - это совсем неплохо - если эффект действитеьно есть - то можно попробовать покрасить аннексин+ПИ и не думать о трансфецированнх клетках.

угу , а если дохнут как раз не трансфецированные клетки ?

субг1 получается на этанол фиксированных за счет "вымывания" фрагментов
хрыматина в фосфатном буффере (можно ускорить по дарцинкевичу) -
внутренние антигены - формалин + дырки .
боюсь в такой комбинации хрыматин не выйдет и субг1 не получится

AnnexinV + DyeCycleViolet + 7AAD - это если вам нужен и апоптоз, и цикл одновременно.

Если внутриклеточное окрашивание предполагается - тогда апоптоз по субG + прямые коньюгаты на ваш белок.
Я так, например, крашу на DNA+ всевозможные транскрипционные факторы (типа KI67) - 7-AAD + PE-anti-KI67, по "спиртовому" или параформальдегидному протоколу (во втором случае пички хуже, но приходится юззать, так как требуется еще окрашивание на многие поверхностные маркеры+ сохранить морфологию).

Внутриклеточное и внутринуклеарное окрашивание без использования прямых коньюгатов - monkey's business. В неспецифике погрязнете..

Получится- но хуже...Деконденсацию можно попробовать (на "флоу" разделе Леонид B cсылки кидал на протокол).

угу, так написано ж что апоптоз вызывается трансфецированным геном. если трансфецировать контрольным вектором -то по видимому никто не дохнет.

Как нас учит Збигнев Дарцинкевич - если дохним апоптозом из Г2 - то "вымыть" нуно больше
100% генома для субГ1-"хуже" не покатит

вполне возможен вариант "стрельбы по соседям" и "апоптозоустойчивости" у
трансфектантов

Спасибо за советы!
По всей видимости придется попробовать сделать fitc-коньюгаты самому. Ими буду красить с mild permeabilisation (сапонин, например) потом - по "спиртовому" протоколу PI..
Дядя ФАКСер, обязательно ли включать в такие эксперименты 7-AAD? Клетки-то фиксированные, следовательно все мертвые?
Aннексин - тоже хорошая идея, но я где-то читал что это не очень надежный метод - слишком много артефактов.. кто-нибудь может прокомментировать насчет этого?

По идее дохнуть действительно должны только трансфецированные клетки....

аннексин вообще-то для живых

Э-э-э...зачем вам 2 раза пермеабилизация? Если окрашивание внутриклетоное и стабильным коньюгатом- то спокойно дырявите клетки 70% этанолом на -20- и красите себе на здоровье синхронно с ДНК-контентом

7-AAD- замена PI, ибо спетр эмиссионный у него юзабельнее для многоцветки, чем у пропидия. В вашем случае- некритично

AnnexinV+dead marker- стандартный метод для оценки апоптоза на нефиксированных клетках.

Вообще-то ничего сложного (на бумаге, на практике см. законы Мёрфи)
Протокол: апоптоз через sub G1, без фиксации но с деконденсацией.
мне нравится PI, д. Ф-р любит 7-AAD. Можно попрововать оба и сравнить.
Ваш белок отлично покрасится первичные ат + вторичные*FITC.

A priori не вижу никаких проблем.
Отвечу на конкретные вопросы по ходу постановки Вами экспериментов.

с "конденсацией" есть древний фокус - формалин +тритон+ пропидий+ цитрат (версен)
в одном флаконе и каплю крови - гонять через 10-20 минут -
получаем два пика - лимфоцыты и гранулоциты - причем сигнал с "конденсированных"
"апоптоз-лайк" гранулоцитов в 2-3 раза сильнее лимфоцитов -
так что формалинить или глутарить "разноконденсации" можно не субГ1 получить,
а суперГ1 для апоптозных .

1: Cytometry. 1995 Feb 1;19(2):183-8.Links
Cell membrane-dependent chromatin condensation.
Vinogradov AE.

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg.

It is shown by means of flow cytometry that during several seconds after cell membrane damage by a non-ionic detergent in physiologically relevant buffer solution, the chromatin of mouse thymocyte nuclei undergoes a drastic decondensation, which is revealed by a sharp increase of binding of DNA-specific fluorochromes (olivomycin or propidium iodide) and of DNA accessibility to DNAse I digestion. A similar change is observed in dead cells. Roughly half of this decondensation can be prevented by lowering the pH of the outside medium to the level known to be inside the cells; the other half remains thus far unexplained (divalent cations and the difference between small anion species seem not to be involved). The approach is based on a novel observation that fixation by formaldehyde conserves chromatin structure before the action of detergent. Flow cytometric assay is proposed for monitoring these condensation/decondensation events in media of different composition. In addition, a new approach to viable/dead cell determination, which has the advantage of immediately fixing the cell state and preserving it for a reasonably long time, is proposed.

без фиксации обычно "шустро руками двигать " приходится

http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin...091222/PDFSTART

ну иногда бывает "не некроз -не апоптоз" где любые методы не катят

http://jcb.rupress.org/cgi/reprint/176/2/231

Еще раз всем спасибо за input!

мне кажется проблема решилась, хотя наверное и не до конца.
Нашлась плазмидка с GFP и моим белком на bidirectional promoter. Придется сначала протестировать как она ведет себя в электропорации, но не в этом суть..

Тут уже было обсуждение одновременного GFP-DNA окрашивания и я так понимаю, лучшим был признан безспиртовой метод (с деконденсацией?).. Опять-таки, лучше брать 7-AAD или Hoecsht вместо PI..

Хотелось бы попробовать как можно больше подходов (чтобы выяснить что работает лучше), поэтому хочу попросить совета в каком порядке было бы логично пробовать методы?

1. Живое окрашивание (annexinV). C учетом того что эффективность трансфекции меньше 50%.
2. GFP-Hoescht/7-AAD безспиртовым методом. Гейтить на GFP и смотреть на апоптоз внутри положительной популяции
3. Непрямое окрашивание антигена FITC с деконденсацией + PI ( или 7-AAD). Гейтить на FITC, смотреть на апоптоз в положительной популяции.
4. Сделать FITC-коньюгаты (признаться, никогда сам не делал) - прямое окрашивание со спиртом + PI (7-AAD).
5. может быть стоит попробовать еще что-нибудь?

Леонид_В, было бы конечно здорово если бы Вы помогли с подробными
протоколами.. я нашел ваши ссылки на французские протоколы в одном из предыдущих топиков - если это те самые, то с переводом проблем не возникнет.

P.S. информация на всякий случай - я работаю с мышиными фибробластами в культуре..

я тут подумал.. если делать GFP-Hoescht33342 то наверное же тоже можно на живых? геморроя меньше..
но тогда видимо нужно еще добавлять live-dead дискриминатор.. 7-AAD?

А на чем смотреть собираетесь? Чтобы подобрать комбинацию меток, желательно бы знать конфигурацию используемого цитометра.

у нас в лабе стоит BD Facscalibur c 488 нм лазером.. для Hoechst он точно не подойдет, но я уверен что нужную машину не проблема найти у соседей...

Для Хехста UV нужен. Или, хотя бы, 405нм возбуждение (хуже, но покатит)

a near-UV laser на 407 nm?..

Да, 405 или 407 - оно самое. Я же выше написал.

7-AAD вообще многофункциональная штука получается..
1. live-dead discrimination. Даже на фиксированных клетках! (тут)
2. замена PI для cell cycle
3. и наконец, маркер для апоптоза! (апоптозные клетки получаются 7-AAD dim, a некротические и мертвые - 7-AAD bright) (тут)

PI обладает той же функциональностью, просто у него спектр эмиссионный менее "удобен" для многоцветки. А так- и то, и то - интеркалятор, стехиометрически вяжущийся. И меток подобного рода ныне- огромное число ( со спектром от фиолетового до near IR - посмотрите на сайте Invitrogen, например)
"Имя им- Легион"(С)

1: Nat Protoc. 2007;2(1):187-90.
Live-cell assay for detection of apoptosis by dual-laser flow cytometry using Hoechst 33342 and 7-amino-actinomycin D.
Schmid I, Uittenbogaart C, Jamieson BD.

Department of Hematology/Oncology, Los Angeles, California 90095, USA. schmid@mednet.ucla.edu

This protocol describes a rapid and simple method for the identification of apoptotic cells. Owing to changes in membrane permeability, early apoptotic cells show an increased uptake of the vital DNA dye Hoechst 33342 (HO342) compared with live cells. The nonvital DNA dye 7-amino-actinomycin D (7-AAD) is added to distinguish late apoptotic or necrotic cells that have lost membrane integrity from early apoptotic cells that still have intact membranes as assayed by dye exclusion. The method is suitable to be combined with cell surface staining using Abs of interest labeled with fluorochromes that are compatible with HO342 and 7-AAD emissions. Surface antigen staining is carried out according to standard methods before staining for apoptosis. The basic assay can be completed in 30 min, and extra time is needed for cell surface antigen staining.

ГФП лучше ЕГФП под 488 нм лазера в 1 канал - тогда пропидий сойдет в красный

http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/...ra.EGFPpH7.html

Аналогично с DyeCycle Violet + 7AAD, или DRAQ5 + MarineBlue

Cтранно, что такую рутинную элементарщину паблишнули в "Природных протоколах"

не поверите, но там даже обычно окрашивание PI публиковали я так понимаю, они все классические протоколы туда принимают.

Ну если публиковали 20 лет назад- то ОК, а если (как вышеуказанную статью)- пару лет назад...Лажа...

может SNAP-tag попробовать ?
http://www.neb.com/nebecomm/products/productS9105.asp