Здравствуйте. Недавно в лаборатории закупили наборы для выделения тотальной РНК из крови (Axygen, AxyPrep blood Total RNA Miniprep Kit). В качестве набора я не сомневался, всё-таки Axygen. Выделение набором производится на колонках (центрифугирование) с предварительным лизисом сначала эритроцитов, затем лейкоцитов. Согласно заявлениям производителя на колонке связывается до 100 мкг РНК (количество крови для выделения 200-400 мкл). Элюция РНК на завершающем этапе производится с пом-ю TE-буфера (60-100 мкл на 1 колонку). Однако концентрация выделяемой РНК составляет (у меня) от 10 до 15 мкг/мл!!! Мне ПОКАЗАЛОСЬ, что этого маловато. В разделе troubleshootings инструкции к набору рекомендуется, в случае малого выхода РНК, повторить элюцию подогретым элюентом, но это не помогло. Вопрос у меня очень простой - нормально ли такое кол-во РНК? Спасибо...

В прикрепленном файле инструкция к набору, если кто заинтересуется.

Сорри... Забыл указать - зачем я собственно выделяю РНК. Все ради real-time ПЦР. Беспокоит поздний выход продуктов амплификации (в районе 35-36 циклов). Мишени - транскрипционные факторы.

"Все-таки Аксиген!..."
Аксиген производит второсортный пластик, а уж киты для молбиологии - побочное производство с ворованными протоколами.
Если на порядок меньше заявленного - кричите караул. "Выделенную РНК" нанесите на аналитический форез - может быть у вас ДНК выделилась!
Если пользоваться Тризолом, но умеючи, выделится РНК без сюрпризов.

С тем, что Axygen производит второсортный пластик я категорически не согласен. Могу с уверенностью и, полагаясь на собственный опыт, сказать, что пластик они производят один из лучших в мире. А вот с наборами AxyPrep Blood KIt у них действительно проблемы, т.к. заявленного кол-ва РНК получить (мне) не удается. И что значит побочное производство с "ворованными протоколами"? Я не представитель фирмы, но если производство есть и даже если оно базируется на ранее известных опробированных методиках, то продукция такого производства тем более должна работать. Уточню свой вопрос. Есть ли у кого-либо опыт работы с наборами выделения РНК из крови (на колонках) и какой при этом выход РНК?

Опыта выделения из крови у меня нет, давайте прикинем. Вы можете определить сколько лейкоцитов (штук) у вас в заданном объеме?
10-15 нг/мкл вполне можно получить, если исходного материала мало.
Я бы а) позвонила бы представителю аксигена, может они чего знают, может у них бетч плохой попался; б) выделила параллельно тризолом, ну или каким другим знакомым китом и сравнила бы качество и количество на выходе.

Не знаю как за весь пластик, но пробирки и типы у них вполне на уровне.

Еще раз добавлю: киты аксигена - какашки, завернутые в красивую обертку. Про пластик тоже добавлю - не все то золото, что блестит. Имхо, зарекся не связываться! Ширпотреб для дураков, одним словом.
Сравнивайте и убеждайтесь.

с чем сравнивать предлагаете? Я имею в виду пластик, из тех, что можно купить в России.

Уважаемый frh5mdI9nB8Yg меня теперь мало интересует ваше отношение к Axygen (или любым другим производителям), я все равно останусь при своём мнении. Утверждать о плохом качестве наборов можно, вероятнее всего, только поработав с ними, но ничего конкретного от Вас я не "услышал". Вот я, например, сравнивать могу с Bio-Rad Blood Kit, но он уже 2 года как не производится. Так вот с этим набором выход РНК был 160 мкг/мл (из 300 мкл крови) и очень чистый препарат. С модифицированным вариантом тризол я тоже работал (YellowSolve), но там выход максимум 45-60 мкг/мл. (из 300 мкл крови) и, при этом, до 30% составляет примесь генДНК! Учитывая размер примесей и потери после обработки ДНазой тризол малоэффективен. Плюсы разве только в стоимости.

Уважаемый frh5mdI9nB8Yg меня теперь мало интересует ваше отношение к Axygen (или любым другим производителям), я все равно останусь при своём мнении. Утверждать о плохом качестве наборов можно, вероятнее всего, только поработав с ними, но ничего конкретного от Вас я не "услышал". Вот я, например, сравнивать могу с Bio-Rad Blood Kit, но он уже 2 года как не производится. Так вот с этим набором выход РНК был 160 мкг/мл (из 300 мкл крови) и очень чистый препарат. С модифицированным вариантом тризол я тоже работал (YellowSolve), но там выход максимум 45-60 мкг/мл. (из 300 мкл крови) и, при этом, до 30% составляет примесь генДНК! Учитывая размер примесей и потери после обработки ДНазой тризол малоэффективен. Плюсы разве только в стоимости.

Попробуйте подсчитать количество лейкоцитов в вашей пробе.

-Вот я, например, сравнивать могу с Bio-Rad Blood Kit, но он уже 2 года как не производится. Так вот с этим набором выход РНК был 160 мкг/мл (из 300 мкл крови) и очень чистый препарат.

Этот чи толи.
http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr...re/4006179C.pdf

Там написано 5-7мкг.

-YellowSolve
Я знаю производителя у него плохо со стабильным воспроизведением реагента.

можно конкретику чем же плох пластик от Ахуген и чей пластик хорош??? а то я тут недавно поставил нескока сотен ПЦРов в их пробирках и вот теперь даже не знаю доверять ли результатам....

-" Ахуген" Аху...ен

-Нескока сотен ПЦРов в их пробирках и вот теперь даже не знаю доверять ли результатам....

Поц-э-э-ровым не доверять всем и О-хуген и всем остальным! У них фамилиЁ не исконное.

То ship: я работала несколько лет с пробирками 1.5мл от аксиген и их типами. Выделяли РНК и всячески над ним измывались. Только в этих пробирках. ПЦР, правда, делали в АБ-геновских, по историческим причинам. И ничего, очень даже приличные результаты, чем не угодил аксиген товарищу ммм непонятно, по-моему он просто поговорить хочет, не пугайтесь

Уважаемый Ъ! Нельзя ли подробнее про пластик от аксигена, так ли он плох. И какие альтернативные варианты. спасибо.

Сказания про ужасный пластик от Axygen сильно преувеличены.
Господин Ъ основные претензии имеет к планшетам, а не к наконечникам и пробиркам.
По китам: уважаемый Ъ, предоставьте на пробу свой кит, пожалуйста, сравним с ахугеновским

По теме вопроса: выделите вручную, проверьте количество РНК.

To ммм (frwHRv5zEzGDY): Действительно набор от Bio-Rad позволял получать около 7 мкг РНК. И я не ошибся, ведь я указал концентрацию (160 мкг/мл), а вы количество. Подсчитайте и получите 8 мкг, чуть больше, чем вами указано.
Надо было создать тему: "Пластик от Axygen - отзывы бывалых"

Собственно! Байрэдовский кит можно самому собрать почитав их MSDS. Если он вам так нравится.

Вообще, если вы пользуете кит задавать вопросы: "Почему у меня не получается" или "что я делаю не так". Имеет смысл только производителю. НЕ НАВИЖУ любые закрытые киты. Ибо если бы производитель сидел у меня в лабе, то мило, а так дистанционный разбор полетов превращается в пустую трату времени и денег.

А пластик... Вы народ, смайлики читать умеете? Кстати шутка была воообще про ПЦР, а не про пластик.

Ну, теперь из БиоРада сделали фирму-специалиста по РНК. Ну ваще Если речь шла о глюкозе и мочевине, я бы промолчал.
Коллеги, ну нельзя покупать что попало у кого попало.
Для выделения РНК, и не только выделения, рекомендую Амбион (входит в состав АБИ-Инвитрогена).
Ну, если хотите экономить, пропись Тризола я недавно давал на форуме (поиск на этой же странице справа вверху) - это самый оптимальный вариант.
Про побочную продукцию Аксигена повторяться не буду - я высказываю мнение пользователей.
Про пластик и не по теме...Аксиген бессовестно врет и пользуется демпингом:
-max recovery пластик - то же самое, что и немах, но обильно смазанное гидрофобной бякой...
-0,5 ПЦР пробирки настолько низкие, что... подходит наверное только под терцик.
- пишут под АБИ совместимость, но на самом деле или застревают или же явно не достают дна ,
- плашки настолько жесткие, что невозможно из резать ножницами...
И так и далее... Да. пластик очень прозрачный. ну просто КРИСТАЛЛ! Но для меня важнее теплопроводность, а не то что как пробирки блестят.
Но есть и плюс, но единственный - пробирки 1,5 настолько туго закрываются, аж со скрипом, что кипятить в них можно без всяких последствий... захочешь не откроешь. Рекомендую Литеху и ДНК технологии свои уникальные ДНК экспрессы в них раскапывать Немножно отвлекся, пардон.
Пластик пока могу рекомендовать АБГен, хотя тоже до конца не испытал....

Все побежали за китами от инвитрогена и амбиона...ну-ну... Скажу еще раз для особо внимательных : у Bio-Rad были и сейчас есть очень хорошие киты для выделения НК и все тут. Никто специалистом Bio-Rad не провозглашал. Если нравится Инвитроген - бог в помощь, можно и Амбион. Можно Qiagen, наконец, рекомендовать - это еще "лучше" (20000 руб на 20 выделений). Пластик от Axygen - очень хороший. Пробирки просто отличные, причем самые разные с плотно притертыми крышками и менее плотно "сидящие". Плашки есть, как те, что режутся, так и монолитные. Вы, кажется рекомендовали АБГен, но пока не испытывали. Значит весь остальной существующий пластик - барохло, да и АБГен возможно тоже?

Я поделился опытом, а Вы оскорбляетесь - не хотите разобраться, как хотите
Откровенно скажу, что никакие киты я не покупаю для текущей работы, а при необходимости я их делаю сам по своим протоколам (ну, может быть кроме Тризола...).
И посылаю подальше продавцов типа Аксигена и Кайгена...
Очень ценю мнение пользователей таких как Вы, а Вы, как пользователь с негативным опытом, не первый и далеко не последний на форуме сайта.
Про пластик... ну и что я долго выбираю поставщика? И делюсь мнением - да, на АБГене на данный момент мой выбор. Если удасться еще больше снизить цены для России, подскажу где покупать.
С уважением, Ъ

To Ъ: Возможно я перегнул палку, но это потому, что хотелось услышать больше конкретных ответов на поставленный вопрос. Мне показалось странно, что так мало людей работавших с китами по выделению РНК на колонках. В любом случае большое спасибо за советы . Буду думать, что можно сделать

--Мне показалось странно, что так мало людей работавших с китами по выделению РНК на колонках.

А мне нет. мне оно показалось закономерным.

"На молбиол надейся, а сам не плошай".

Я просканировал сайты некоторых производителей китов по выделению РНК из небольших объемов крови человека (Qiagen, Ambion, Promega...), но без учета наборов в 96-луночном формате и для выделения на автоматических станциях. Решил поделиться полученной информацией

Сначала о китах от Ambion. Производят набор RiboPure (есть еще множество наборов, но рассчитанные на большие обёмы крови). Получаемая концентрация РНК, этим набором RiboPure 2-4мкг из 500 мкл крови.

Теперь о промеговских. У промеги я не нашел наборов, специально разработанных для выделения РНК из крови. Но есть SV Total RNA Isolation System, кот-й якобы может использоваться для выделения из образцов цельной крови. На сайте promega.com дана ссылка на статью Kephart, D. and Shenoi, H. (1999) Can the SV RNA Isolation System be used to purify RNA from frozen, unprocessed whole blood? согласно которой из 200 мкл свежей крови выход РНК составил 2.26 мкг.

Наконец Qiagen. У них есть набор QIAamp® RNA Blood Mini. Набор рассчитан на выделения из 1 мл образца. Выход РНК 3 мкг.

Важно, что протоколы от Promega, Qiagen, Ambion и Axygen очень похожи. Так, что следует говорить не о побочном производстве с ворованными протоколами, а об использовании единой технологии, но под разными марками. Каждый производитель лишь вносит некоторые изменения.

Теперь, что касается Axygen - я проделал серию выделению с подогретым элюентом (60 мкл) до Т 70С (ранее пробовал до 50С, что неправильно). В результате концентрация во всех образцах была около 50 мкг/мл, общий выход составил в каждом образце около 3 мкг. A260/280 1.8.

Вывод напрашивается сам собой - киты от Аксигена не уступают вышеперечисленным. А мои сомнения по поводу количества РНК оказались ошибочными. Одна ремарка, на сайте axygen.com указано, что на 1 колонке набора AxyPrep blood Total RNA Miniprep Kit связывается до 100 мкг РНК(!!!). Но это лишь теоретически, поскольку реально получить даже из 1 мл крови 100мкг РНК невозможно! Такая информация вводит в заблуждения.

Большой плюс, что киты от Аксиген не так дороги.

LOL. I used to cut but this was so long ago that I totally forgot that plates can be cut...luxury corrupts, I guess.

I used their 1.5s, no complains. In fact, I was so pissed with VWR tubes that kept popping when heated or when freezing larger volumes that I specifically ordered 1.5s from Bio-Rad and Axy cause their caps are tight.

As for the "stolen protocols" as far as I know the silica protocol is IP free, so it can't be stolen.

Я же не говорю, что силика-протокол я придумал и Аксиген у меня спёр. В том то и дело, что их. протоколов, туева хуча, а Аксиген "придумал" свой, самый не удачный, ИМХО.

От ДНК избавляются осождением изопропанолом, а супер с РНК наносит спин-колонку. Это же надо такое придумать.
Да фиг с ним с протоколом, лишь бы РНК выделялась и, самое главное, работала.

Вы не упомянули хороший кит для выделения РНК из крови от Zymo Research, коими торгует Русбиолинк. Я выделяю РНК и размороженной! (один раз, как правило) крови. Выделяла Invitek, Quiagen и ZR. Первые два очень похожи, выход из 1,5 мл около 200 нг, из свежей (2-3 часа в термосе, пока до лабы доеду) крови выделяется в 50 раз больше. ZR из 200 мкл крови даёт те же 200 нг. Пользовалась инвитрогеновским прибором для измерения концентрации НК Qubit.
Делайте выводы, господа.
Дедушкины методы, конечно, рулят, но время... 2 дня или 2 часа?

Если это успех систематический, скажем в пяти дублях подряд, господа могут делать выводы - о, это класс!
Я лично отношесь "к этому преимуществу" скептически - метод один и тот же, колоночки из одного источника. Но возможно ZR продвинулся с составои растворов. Но две последовательные колонки в одном выделении очень жирно.
Да фиг с ним с колоночками, пусть хоть пять, лишь бы она была на выходе и живая.

Успех систематический, проверено. РНК живее всех живых: ко-шаперон ловится спокойно и без проблем (праймеры с зондом грамотные, с геномной ДНК ампликона не получится). У ZR кстати и концентрационные колонки в наборе есть, которые работают и с кДНК. Стоит это счастье 18000 рублей (без ндс) на 100 выделений.

А с неграмотными праймерами и пробами?
Рассказывайте сказки в другом месте - на микроколоночках РНКу, свободную от ДНКа, еще никому не удавалось выделить. Без специальной обработки.

Похоже, Интернет восстановился.

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile

Не следует, однако, забывать, что дальнейшее развитие различных форм деятельности обеспечивает широкому кругу (специалистов) участие в формировании идей по выходу из сложившейся ситуации. https://myanimelist.net/profile/bogdan33w6

Задача организации в особенности же новая модель организационной деятельности укрепляет нас, в нашем стремлении улучшения соответствующих моделей активизации. https://www.metal-archives.com/users/pasha15x7

But there were darker สล็อตออนไลน์ sides to British rule in Singapore UFA1688 too. Experts point out the colonial ลิงค์รับทรัพย์ administration suppressed แฮนดิแคป the local identity and aff 1688 made English the official language. ufabet เข้า สู่ระบบ They also say modern Singapore’s ทางเข้าufa1688 infamous tough stance บอลสเต็บ towards hard drugs was ราคาบอล a result of colonial Britain’s lucrative ufa1688 opium trade.

Задача организации в особенности же начало повседневной работы по формированию позиции в значительной степени обусловливает создание соответствующих моделей активизации. https://www.borderlandrainbow.org/profile/kostja48k/profile

Таким образом сложившаяся ситуация ни коим образом не создает все необходимые предпосылки для утверждения новейших вариантов поиска решений. https://www.theedwardfoundation.co.uk/profi...rtem65f/profile

Хотя на самом деле уже очевидно, что движение в данном направлении позволяет выполнить важные задания по разработке системы массового участия. https://www.traditionalanimation.com/author/valik13u/

Повседневная практика показывает, что консультации с широким активом создает все необходимые предпосылки для утверждения направлений прогрессивного развития. https://www.outlived.co.uk/author/slava46c/

On the other hand further development of different forms of activity requires the analysis of corresponding models of activation from us. https://docs.google.com/document/d/1UbmqN0R...vJaFhZirEw/edit

Watch Factory Global Delivery Besuchen Sie die Website für weitere Stile:
https://www.watches-replica.de/
https://www.fake-rolex.de/
https://www.aaawatches.de/
replica uhren audemars piguet
replica uhren bell and ross
replica uhren breitling
replica uhren cartier
replica uhren franck muller
replica uhren hublot
replica uhren iwc
replica uhren omega
replica uhren rolex
replica uhren panerai
replica uhren patek philippe
replica uhren tag heuer
replica uhren vacheron constantin
vertrauenswürdige replica uhren
replica uhren
rolex replica
fake rolex
rolex fake
fake rolex kaufen
uhren replica
fake uhren
replica uhren kaufen
beste uhren
o-fake
replica uhren deutschland legal
replica uhren kaufen legal
replica uhren schweiz legal
replica uhren Österreich legal
fake-rolex.de erfahrungen
fake rolex kaufen