Author: mahayana
Email: hwang@chem.uga.edu
Date Posted: 10/22/02

I am preparing samples for NMR.

I used a protocol using M9 Media from beginning to end. M9 agar plate, 3ml growth, 100ml growth, spin down and resuspend cells with clear M9(without salt), then add isotope to 1L M9 media and grow . It is too slow, the whole procedure need a whole week. So I change to a new protocol, use LB plate and 3ml LB for growth, then spin down and resuspend cells with M9 media, transfer it to 100ml M9, at this step I added isotopes. Everything others is the same with the old protocol. It is really fast. but I got diffirent protein. from the gel, its weight is 4KDa more than what we got using the first protocol. I am frustrated, the isotope is $150/gram, I used 10 grams and got nothing.
Anyone could help me?
I really appreciate the help!

А бывает. Во всяком случае, я выделял из Synechocystis белок за 6xHis-tag, и в зависимости от условий выращивания очень разная картина получалась в финальном выделении. И тоже куча какого-то левого белка, если при 37 С, а не при 30 С.

Дима, я не о том. Я, скорее, о лице его шефа, узнавшего наконец, что юноша подбирает условия на МЕЧЕНОй среде.

А, ну это да! Мощно деньги тратит.

ну так он же
used protocol from beginning to end
чего голову то себе морочить?

может он и не знает, что бывает немеченая среда

Пожалуй что так. А ежели бы он до меченой LB дорвался, было бы и того веселее.

непонятно только , что это за 150у.е.? хлорид (сульфат) аммония стоит как минимум в 3 раза дешевле, а ежели глюкоза (глицерин) то почему аж 10г!! на литр!? в таком случае это уже проблема шефа, коль он такую рецептуру М9 выдал.
А на самом деле все ж лучше с изотопами эспериментировать, только не в 1 литре, а в 1 мл или того меньше.

С изотопами когда на обычной среде внятный результат имеется. Иначе полная бессмыслица. Ну а что до процентности... Похоже он каждый раз по 100 мл берет. Так вполне можно с десятью граммами управиться.

И потом, количество глюкозы и глицерина - параметры довольно широкие. Может быть сильно разнообразно.

неа, 100 мл у него прекультура, а сама культура 1литр с изотопами "then add isotope to 1L M9 media and grow". я возмущалась про то, как они изотопы используют и от куда такие цены или на что такие цены, и почему 10г/л. Стандартная М9: 1г/л какого-нить азота, ну и 2-4 г углерода, т.е. глюкозы или глицерола. Если он писал про усредненную цену на все, то тогда понятно, а так.. Про результат, так надо было, как ты правильно отметил, не на литре М9 с изотопами упражняться. У нас проактикуются упражнения на оччень маленьких объемах и с изотопами.

Очень маленькие об"емы - хорошо, может быть, посвоему, но потом может вылезти проблема масштабирования которая может оказаться покруче изотопного эффекта. Хотя может быть я и не прав и не круче. У меня опыт с замещениями не богатый и когда я делал, то было сказано четко: оптимизируешь по количеству и соотношению глюкозы и глицерина, а там уж получиш изотопы. Азот в рассмотрение не шел ввиду дешевисны. Оптимизацию я делал на доллар на милиграмм белка, благо белок продуцировался хорошо.

Впрочем, тебе и так известно. Нравы поменялись?

это все понятно, по поводу глюкозы и глицерина, вот только студент пишет про 1 изотоп и у меня закрадываются подозрения, что это таки 15N, т.к. это обычное дело, а вот получать однозамещенный по углероду, как то не очень. Короче, непонятно, если только по азоту, то почему аж 10г, а если только по углероду, то для чего опять же 10г. или для студента изотоп это единоцелое, в одном наборе N и С )))
Р.S. какие нравы? я чего-то притормаживаю слегка, после рисования картинок всевозможных.

Нравы в институте относительно того чего как тратить. Тогда оптимизация делалась на обычной М9.

Ну а целое - не целое для него одним их индусским богам известно. 10 г по углероду... Ну если он не раз йето делал в большом об"еме, то мог и больше извести. Дурное дело, оно ведь не очень хитрое.

нравы поменялись и сильно, так как новый хозяин теперь, но и до этого у каждого был свой поход.