Добрый день!
У меня нет опыта работы с FACS-машиной, но есть острая необходимость достоверно посчитать процент клеток, экспрессирующих белки с ядерной и цитоплазматической локализацией. Иммуноцитофлуоресцентная микроскопия не дает достоверных результатов, поэтому решила использовать FACS-анализ. Сам анализ делает специалист, но клетки готовить, естественно, мне. Первые покраски были сделаны на поверхностные маркеры, все получилось замечательно. А когда перешли на внутриклеточные белки, началась полная ерунда. Поскажите, пожалуйста, для внутриклеточных белков должны быть какие-то особые настройки FACSа? И какие существуют особенные тонкости окрашивания антителами для FACS-анализа?
Пожалуйста, помогите!!!!
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
FACS -анализ клеток, окрашенных на внутриклеточный белок
Larifa, 14.03.2010 11:21
Дядя ФАКСер, 14.03.2010 15:31
Что красите? Какие клетки?
Current Protocols - в помошь.
P.S. Локализацию на проточке не определите )не разделите ядерную и цитоплазматическую)- тут вам LSC или Amnis Imaging cytometry только поможет.
Current Protocols - в помошь.
P.S. Локализацию на проточке не определите )не разделите ядерную и цитоплазматическую)- тут вам LSC или Amnis Imaging cytometry только поможет.
Эмин, 14.03.2010 20:17
И в чём заключалась ерунда? Что не понравилось?
Смотрели ли те же образцы, что потом мерили на проточнике, под флуоресцентным микроскопом?
Смотрели ли те же образцы, что потом мерили на проточнике, под флуоресцентным микроскопом?
Леонид В, 15.03.2010 18:53
(Дядя ФАКСер @ 14.03.2010 08:31)
Что красите? Какие клетки? Current Protocols - в помошь.
P.S. Локализацию на проточке не определите )не разделите ядерную и цитоплазматическую)- тут вам LSC или Amnis Imaging cytometry только поможет.
Вообще - согласен, в частности - нет.
Первый путь (очень зыбкий):
сапонин (дигитонин) по известным причинам дырявит только плазматическую, а ядерную не берёт. Соответственно разница между позитивами тритон vs сапонин может до некоторой степени отражать ядерно-плазматический индекс.
Второй путь (нормальный)
раскрошить цитоплазму и гонять ядра vs целые клетки. Разница будет отражать ядерно-плазматический индекс.
Дядя ФАКСер, 15.03.2010 20:43
Ну если ухищряться- то верно. Но, как я понял, изначально стояла задача получить на одном образце и поверхностные маркеры, и- локализацию.
Леонид В, 15.03.2010 23:33
(Дядя ФАКСер @ 15.03.2010 13:43)
Ну если ухищряться- то верно. Но, как я понял, изначально стояла задача получить на одном образце и поверхностные маркеры, и- локализацию.Ой, а я тут вчитался в исходное послание и стали грызть меня сомнения. Такое ощущение, что об индексе речь вообще не идёт. Просто люди хотят внутриклеточные белки пометить.
Вообще автор, дорогой, хорошо и четко поставленный вопрос это уже половина ответа.
Не могли бы Вы изложить в форме недопускающей догадки и толкования Вашу проблему.
tkachev victor, 12.06.2010 13:15
Извините, что встреваю в чужую тему со своим вопросом. Но название темы поностью отражает суть моей проблемы. До этого с окрашиванием на внутриклеточные белки дело не имел.
Пытался на FACSе определить количество лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточные маркеры Th1 и Th2 клеток. Для этого на первом этапе покрасил на CD3 (лучше было бы на CD4, но не было возможности) и CD45 (все антитела BioLegend рабочие, титр предварительно подобран, клетки светятся ярко). На втором этапе покрасил красил на GATA3 и Tbet. Антитела eBioscience в концентрации, рекомендованной производителем. Использовал в соответствии с их же рекомендациями сет для пермебилизации/фиксации (FoxP3 Staining set). Все процедуры делал по протоколу.
Результат - разрушенные клетки (если я правильно понял: клетки сместились к нулю по оси FSC), практически исчез сигнал с CD45 и CD3.
В чем тут может быть дело?
Заранее спасибо.
Пытался на FACSе определить количество лимфоцитов, экспрессирующих внутриклеточные маркеры Th1 и Th2 клеток. Для этого на первом этапе покрасил на CD3 (лучше было бы на CD4, но не было возможности) и CD45 (все антитела BioLegend рабочие, титр предварительно подобран, клетки светятся ярко). На втором этапе покрасил красил на GATA3 и Tbet. Антитела eBioscience в концентрации, рекомендованной производителем. Использовал в соответствии с их же рекомендациями сет для пермебилизации/фиксации (FoxP3 Staining set). Все процедуры делал по протоколу.
Результат - разрушенные клетки (если я правильно понял: клетки сместились к нулю по оси FSC), практически исчез сигнал с CD45 и CD3.
В чем тут может быть дело?
Заранее спасибо.
Дядя ФАКСер, 12.06.2010 15:57
Кит не просроченный? Сколько инкубировали?
Не забыли ли до пермеабилизации зафиксировать клетки?
Не забыли ли до пермеабилизации зафиксировать клетки?
Дядя ФАКСер, 12.06.2010 16:00
Кстати, при фиксации-пермеабилизации размер клеток уменьшается, так что уменьшение FS- совершенно нормально. Это интактные клетки.
А вот пропажа сигнала...Если вы стимуомровали клетки перед окрашиванием, до происходит даунрегуляция экспрессии CD3.
С другой стороны - что за антитела использовали (производитель- лот) и с каким флуорохромами?
А вот пропажа сигнала...Если вы стимуомровали клетки перед окрашиванием, до происходит даунрегуляция экспрессии CD3.
С другой стороны - что за антитела использовали (производитель- лот) и с каким флуорохромами?
tkachev victor, 12.06.2010 18:08
1. Кит не просроченый. Только получил. Там первый компонент буфер для фиксации/пермеабилизации (содержит формальдегид и компонент о котором можно только догадываться, потому что производитель ничего о нем не сообщает - наверное Triton X100). Ин7кубировал с ним клетки после имунофенотипирования 20 минут.
2. Слишком уж FSC снижается. Если бы не знал что там были клетки - сказал бы что это мусор. (до этого мне приносили пробы пермеабилизированные с помощью 0,1% Triton X100 примерно та же картина была).
3. Спасибо за ценную информацию. В будущем нужно будет стимулировать клетки PMA+иономицин, так что буду готов к снижению экспрессии CD3. Но в этот раз были спленоциты мыши (только что выделенные). Антитела BioLegend СD3-FITC #100203, CD45-PerCP #103129. Как говорил выше их рабочий титр установил заранее. Все было нормально.
2. Слишком уж FSC снижается. Если бы не знал что там были клетки - сказал бы что это мусор. (до этого мне приносили пробы пермеабилизированные с помощью 0,1% Triton X100 примерно та же картина была).
3. Спасибо за ценную информацию. В будущем нужно будет стимулировать клетки PMA+иономицин, так что буду готов к снижению экспрессии CD3. Но в этот раз были спленоциты мыши (только что выделенные). Антитела BioLegend СD3-FITC #100203, CD45-PerCP #103129. Как говорил выше их рабочий титр установил заранее. Все было нормально.
Дядя ФАКСер, 12.06.2010 21:04
1. Хм, точно по протоколу работали? Что-то меня сомнения берут... eBioscience-овский Fix/Perm не 1-step
2. в 2 раза падает- нормально.
3. Рабочий титр для подобных антител не надобно устанавливать- лучше использовать ту дозу, которую рекомендует производитель, а не меньшую.
2. в 2 раза падает- нормально.
3. Рабочий титр для подобных антител не надобно устанавливать- лучше использовать ту дозу, которую рекомендует производитель, а не меньшую.
tkachev victor, 13.06.2010 13:08
1. Вот ссылка на используемый кит. www.ebioscience.com/ebioscience/specs/antibody_00/00-5523.htm
Вот что пишут в мануале eBioscience (одностадийное окрашивание на внутриклеточные маркеры). Этапы после фенотипирования.
After the last wash, discard the supernatant and vortex the sample to completely dissociate the pellet.
5. Add 1 ml of Fixation/Permeabilization working solution to each sample and vortex.
6. Incubate at 4°C or room temperature for 30 minutes in the dark.
7. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
8. Resuspend the cell pellet in 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer).
9. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
10. [Optional] Block with 2% (2l) normal mouse/rat serum in Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) (in approximately 100 l total volume) at 4°C for 15 minutes.
11. Without washing, add the recommended amount of fluorochrome-conjugated antibody for detection of intracellular antigen to cells and incubate in the dark at 4°C for at least 30 minutes.
12. Add 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) to each tube and vortex.
13. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
14. Add 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer).
15. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
16. Resuspend stained cells in an appropriate volume of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) and acquire data on a flow cytometer.
Вот аналогичное описание от BioLegend
Perform cell surface staining as described in BioLegend’s Cell Surface Immunofluorescence
Staining Protocol
2. Add 1 ml of 1X BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm solution to each tube, vortex
and incubate at room temperature in the dark for 20 minutes, then spin
down the cells and remove the supernatant.
3. Wash once with cell staining buffer (Cat. No. 420201) by spinning at 250 X g
for 5 minutes and remove the supernatant.
4. Wash once with 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm buffer.
5. Re-suspend cells in 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm buffer, incubate at
room temperature in the dark for 15 minutes, spin down cells and discard
the supernatant, then resuspend the pellet in 100 μl of 1X BioLegend’s
FOXP3 Perm buffer.
6. Add appropriate amount of fluorochrome conjugated anti-FOXP3 antibody
and incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
7. Wash twice with cell staining buffer, and resuspend in 0.5ml cell staining
buffer then analyze with flow cytometer with appropriate instrument
setting.
2. падает немного больше чем в 2 раза.
3. Не готов спорить, но раститровывать антитела не я придумал. Собственно на всех сайтах производителей антител рекоменлуют сначала установить рабочий титр антител. При разведении антител в этом исследовании в 5 раз не изменялись ни количество позитивных событий, ни интенсивность флуоресценции в позитивном регионе.
Вот что пишут в мануале eBioscience (одностадийное окрашивание на внутриклеточные маркеры). Этапы после фенотипирования.
After the last wash, discard the supernatant and vortex the sample to completely dissociate the pellet.
5. Add 1 ml of Fixation/Permeabilization working solution to each sample and vortex.
6. Incubate at 4°C or room temperature for 30 minutes in the dark.
7. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
8. Resuspend the cell pellet in 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer).
9. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
10. [Optional] Block with 2% (2l) normal mouse/rat serum in Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) (in approximately 100 l total volume) at 4°C for 15 minutes.
11. Without washing, add the recommended amount of fluorochrome-conjugated antibody for detection of intracellular antigen to cells and incubate in the dark at 4°C for at least 30 minutes.
12. Add 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) to each tube and vortex.
13. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
14. Add 1 ml of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer).
15. Centrifuge samples at 300-400 xg at 4°C for 5 minutes, then discard the supernatant.
16. Resuspend stained cells in an appropriate volume of Flow Cytometry Staining Buffer (eFluor® NC Flow Cytometry Staining Buffer) and acquire data on a flow cytometer.
Вот аналогичное описание от BioLegend
Perform cell surface staining as described in BioLegend’s Cell Surface Immunofluorescence
Staining Protocol
2. Add 1 ml of 1X BioLegend’s FOXP3 Fix/Perm solution to each tube, vortex
and incubate at room temperature in the dark for 20 minutes, then spin
down the cells and remove the supernatant.
3. Wash once with cell staining buffer (Cat. No. 420201) by spinning at 250 X g
for 5 minutes and remove the supernatant.
4. Wash once with 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm buffer.
5. Re-suspend cells in 1ml 1X BioLegend’s FOXP3 Perm buffer, incubate at
room temperature in the dark for 15 minutes, spin down cells and discard
the supernatant, then resuspend the pellet in 100 μl of 1X BioLegend’s
FOXP3 Perm buffer.
6. Add appropriate amount of fluorochrome conjugated anti-FOXP3 antibody
and incubate at room temperature in the dark for 30 minutes.
7. Wash twice with cell staining buffer, and resuspend in 0.5ml cell staining
buffer then analyze with flow cytometer with appropriate instrument
setting.
2. падает немного больше чем в 2 раза.
3. Не готов спорить, но раститровывать антитела не я придумал. Собственно на всех сайтах производителей антител рекоменлуют сначала установить рабочий титр антител. При разведении антител в этом исследовании в 5 раз не изменялись ни количество позитивных событий, ни интенсивность флуоресценции в позитивном регионе.
Дядя ФАКСер, 13.06.2010 13:23
Я много раз в течение многих лет искомые киты использовал и испольщую- никогда проблем с потерей сигнала не было.
Клетки- мышь, человек, обезьяна.
Рекомендую не разводить антитела.
Клетки- мышь, человек, обезьяна.
Рекомендую не разводить антитела.
Леонид В, 14.06.2010 20:48
(tkachev victor @ 12.06.2010 11:08)
1. Кит не просроченый. Только получил. Там первый компонент буфер для фиксации/пермеабилизации (содержит формальдегид и компонент о котором можно только догадываться, потому что производитель ничего о нем не сообщает - наверное Triton X100).К сути Вашего вопроса не относится, но обычно в этих наборах используют производные дегитонина. Надо полагать тритон в первые минуты, пока клетки не фиксированы как следует, такого может напахать, что родная мама эти клетки не узнает.
В Вашем случае скорее всего происходит тотальная потеря образца в центрифуге. Фикс-перм клетки значительно меняют плавучую плотность, после этого осаждаются в 5 раз хуже. А если тормоз центрифужный использовать, да если ротор плохо уравновешен, то тогда вообще караул.
Проверьте данную теорию прежде чем копать дальше.
tkachev victor, 15.06.2010 18:12
Спасибо за совет.
Событий, конечно, стало существенно меньше после фиксации/пермеабилизации, но ничего не поделаешь - приходится много крутить клетки, причем очень щадяще, так как боюсь, что они у меня разлетятся на мелкие кусочки.
Завтра буду переделывать - тогда, наверное и узнаю, что к чему.
Событий, конечно, стало существенно меньше после фиксации/пермеабилизации, но ничего не поделаешь - приходится много крутить клетки, причем очень щадяще, так как боюсь, что они у меня разлетятся на мелкие кусочки.
Завтра буду переделывать - тогда, наверное и узнаю, что к чему.
tkachev victor, 15.06.2010 18:44
Кстати еще такой вопрос. Какой состав Fixation/Permeabilisation и Permeabilisation buffer (в FoxP3 Staining Buffer Set ) у eBioscience и BioLegend?
И почему у них отличаются протоколы окрашивания на внутриклеточные белки? Почему у eBioscience используется только Fix/Perm и не используется Permeabilisation buffer (зачем он тогда вообще?), а у BioLegend используются эти оба компонента?
И почему у них отличаются протоколы окрашивания на внутриклеточные белки? Почему у eBioscience используется только Fix/Perm и не используется Permeabilisation buffer (зачем он тогда вообще?), а у BioLegend используются эти оба компонента?
Леонид В, 15.06.2010 19:38
(tkachev victor @ 15.06.2010 11:44)
Кстати еще такой вопрос. Какой состав Fixation/Permeabilisation и Permeabilisation buffer (в FoxP3 Staining Buffer Set ) у eBioscience и BioLegend?И почему у них отличаются протоколы окрашивания на внутриклеточные белки? Почему у eBioscience используется только Fix/Perm и не используется Permeabilisation buffer (зачем он тогда вообще?), а у BioLegend используются эти оба компонента?
Данных конкретных наборов не использовал, однако компании не стремятся раскрывать состав реагентов полностью.
Протоколы отличаются потому, что одни адаптировали свой к одним реагентам и условиям, другие к другим. На любой банальной тест-системе результаты, скорее всего, будут почти идентичными.
У нас в Центре нет ни одной лаборатории использующей наборы с готовыми растворами для таких простых задач. Все предпочитают
а) экономить (но это вопрос бюджета, у богатых свои взгляды)
б) иметь контроль над всеми стадиями протокола. Когда используешь буфер неизвестного состава, то не очень понятно, как быть если что-либо не работает.
Дядя ФАКСер, 15.06.2010 21:39
(tkachev victor @ 15.06.2010 17:44)
? Почему у eBioscience используется только Fix/Perm и не используется Permeabilisation buffer (зачем он тогда вообще?)
Вот протокол:
1. Add 100 μl of prepared cells (approximately 1x106 cells) to each tube.
2. Add 20 μl of CD4/CD25 cocktail (1 μg CD4 and 0.125 μg CD25) to each tube. Incubate at 4°C for
30 minutes in the dark.
3. Wash cells one time in cold Flow Cytometry Staining Buffer (or cold PBS). Centrifuge to pellet the
cells and then discard the supernatant.
4. Resuspend cells in the residual buffer by pulse vortexing and then add 1 ml of freshly prepared
Fixation/Permeabilization working solution to each sample. Pulse vortex again.
5. Incubate for 30 - 60 minutes at 4°C in the dark.
6. Wash cells one time by adding 2 ml 1X Permeabilization Buffer. Centrifuge to pellet the cells and
then discard the supernatant.
7. Repeat step 6.
8. [OPTIONAL] Block by adding 2 μl of normal rat serum (2% v/v final concentration) in
approximately 100 μl final volume. Incubate at 4°C for 15 minutes in the dark.
9. Without washing after the blocking step, add the recommended test size volume (indicated on
the vial) of anti-human Foxp3 (PCH101) antibody or rat IgG2a isotype control and incubate at 4°C
for at least 30 minutes in the dark.
Note: It is highly recommended to titrate the antibody for optimal staining performance in the assay
of interest.
10. Wash cells one time with 2 ml 1X Permeabilization Buffer. Centrifuge to pellet the cells and then
discard the supernatant.
11. Repeat step 10.
12. Resuspend cells in an appropriate volume of Flow Cytometry Staining Buffer and analyze on a
flow cytometer.
2. Add 20 μl of CD4/CD25 cocktail (1 μg CD4 and 0.125 μg CD25) to each tube. Incubate at 4°C for
30 minutes in the dark.
3. Wash cells one time in cold Flow Cytometry Staining Buffer (or cold PBS). Centrifuge to pellet the
cells and then discard the supernatant.
4. Resuspend cells in the residual buffer by pulse vortexing and then add 1 ml of freshly prepared
Fixation/Permeabilization working solution to each sample. Pulse vortex again.
5. Incubate for 30 - 60 minutes at 4°C in the dark.
6. Wash cells one time by adding 2 ml 1X Permeabilization Buffer. Centrifuge to pellet the cells and
then discard the supernatant.
7. Repeat step 6.
8. [OPTIONAL] Block by adding 2 μl of normal rat serum (2% v/v final concentration) in
approximately 100 μl final volume. Incubate at 4°C for 15 minutes in the dark.
9. Without washing after the blocking step, add the recommended test size volume (indicated on
the vial) of anti-human Foxp3 (PCH101) antibody or rat IgG2a isotype control and incubate at 4°C
for at least 30 minutes in the dark.
Note: It is highly recommended to titrate the antibody for optimal staining performance in the assay
of interest.
10. Wash cells one time with 2 ml 1X Permeabilization Buffer. Centrifuge to pellet the cells and then
discard the supernatant.
11. Repeat step 10.
12. Resuspend cells in an appropriate volume of Flow Cytometry Staining Buffer and analyze on a
flow cytometer.
tkachev victor, 16.06.2010 04:45
Большое спасибо!
tkachev victor, 17.06.2010 05:13
Переделал окрашивание. Сигнал с поверхностных маркеров никуда не пропал. Даже интенсивность его осталась примерно на прежнем уровне. Правда (не знаю как проще сказать...), увеличилось значение интенсивности сигнала негативных событий по CD3 (при простом фенотипировании CD3-все лежали в области от 0 до 10 ед, после фиксации/пермеабилизации и окрашивания на внутриклет. маркеры - где-то от 10 и выше, но все равно четко разделяются области CD3- и CD3+).
И событий стало очень-очень мало. Можно откручивать пермеабилиированные клетки на высоких оборотах, чтоб не потерялись при отмывке, они при этом не развалятся?
И событий стало очень-очень мало. Можно откручивать пермеабилиированные клетки на высоких оборотах, чтоб не потерялись при отмывке, они при этом не развалятся?
Дядя ФАКСер, 17.06.2010 09:12
Все нормально- аутофлуоресценция при фиксации увеличивается.
Открутка- да, ведется на более высоких оборотах (примерно на 30% быстрее). И- аккуратность
Ибо film-like pellet потерять куда как прозе, нежели обычный.
Открутка- да, ведется на более высоких оборотах (примерно на 30% быстрее). И- аккуратность
Ибо film-like pellet потерять куда как прозе, нежели обычный.
tkachev victor, 17.06.2010 11:51
ну вот я видно и теряю 
Хотя вроде стараюсь аккуратно работать. Ну ничего, думаю, руку набью.
Хотя вроде стараюсь аккуратно работать. Ну ничего, думаю, руку набью.
Дядя ФАКСер, 17.06.2010 12:23
Клеток на семпл побольше. Как показывает опыт, после всех откруток-отмывок, для внутриклеточного стейнинга, даже при самой аккуратной работе, теряется не менее 30-40% клеток.
Леонид В, 17.06.2010 16:29
(Дядя ФАКСер @ 17.06.2010 05:23)
теряется не менее 30-40% клеток.именно, именно.
и еще ...
мы присобачили к цитометру переходник и работаем уже много лет в эппендорфах (1,5 мл).
Ротор у центрифуг наклонный, поэтому осадок образуется вытянутый, с «хвостом» на стенке пробирки. Крутим два раза: один раз «пендюркой» вверх, потом лёгким движением пальца все пробирки переворачиваются «пендюркой» вниз. И ещё 30 секунд. Все клетки собираются кучкой на дне.
Но самый лучший способ борьбы с потерями это, как уже сказал ДФ, увеличение (если возможно) количества клеток в образце. В наших условиях рекомендую минимум 100.000 кл на образец, а в конце они разводятся в 50 микролитрах. И тогда, выпив почти все 50 мкл набирается 10 тыс нужных клеток. Но это экстрим. Лучше брать миллион, тогда не ошибёшься.
Леонид В, 17.06.2010 16:32
(Дядя ФАКСер @ 17.06.2010 02:12)
Все нормально- аутофлуоресценция при фиксации увеличивается.и еще добавляется солидная неспецифика от внутриклеточных сайтов связывания. Изнутри клетку помыть сложнее да и возможностей прилипнуть там у антител значительно больше.
Дядя ФАКСер, 17.06.2010 16:37
Тоже верно.
Собственно, потому желательно работать только с прямыми коньюнатами при ICS.
Собственно, потому желательно работать только с прямыми коньюнатами при ICS.
tkachev victor, 21.06.2010 14:04
(Леонид В @ 17.06.2010 14:29)
и еще ...
мы присобачили к цитометру переходник и работаем уже много лет в эппендорфах (1,5 мл).
Ротор у центрифуг наклонный, поэтому осадок образуется вытянутый, с «хвостом» на стенке пробирки. Крутим два раза: один раз «пендюркой» вверх, потом лёгким движением пальца все пробирки переворачиваются «пендюркой» вниз. И ещё 30 секунд. Все клетки собираются кучкой на дне.
А не подскажите, сколько по времени и на каких оборотах (или g) крутите?
Леонид В, 22.06.2010 18:21
(tkachev victor @ 21.06.2010 07:04)
А не подскажите, сколько по времени и на каких оборотах (или g) крутите?Классическая настольная центфужка эппендорф. В «жестком» случае для фиксированных клеток используется кнопка Quick Spin (раскручивает до 12000 rpm). Через 20 секунд палец с кнопки снимаем, фуга медленно останавливается (никаких тормозов или останавливаний пальцем и прочими предметами ). Одним круговым изящным движением большого пальца переворачиваем эппендорфы «пимпочками» вниз. Жмём на книпку 10 секунд. Вынимаем, отсасываем супер,
«брррррррыкаем» пробирку о рифлёную поверхность (ресуспендирование осадка). Добавляем следующий раствор.
Дядя ФАКСер, 22.06.2010 22:25
Эквилибристы 
Радимира, 11.11.2010 09:02
Здравствуйте, люди добрые! Вопрос к Леониду В. или может, кто еще знает...
Мы используем кит biolegend для окрашивания поверхностных и внутриклеточных белков, естесссственно пытаемся экономить)))))))))))) Добавляем антитела не в рекомендованном производителем объеме 20 мкл, а 5 мкл, соответственно, на все пробы fix/perm-буфера и perm-буфера не хватит. Есть ли у кого пропись если не их самих, то таковых, которые могут их заменить? Будем очень признательны!!!
Мы используем кит biolegend для окрашивания поверхностных и внутриклеточных белков, естесссственно пытаемся экономить)))))))))))) Добавляем антитела не в рекомендованном производителем объеме 20 мкл, а 5 мкл, соответственно, на все пробы fix/perm-буфера и perm-буфера не хватит. Есть ли у кого пропись если не их самих, то таковых, которые могут их заменить? Будем очень признательны!!!
Дядя ФАКСер, 11.11.2010 12:01
Ну и ничего путного не получится при "экономии"- проверено. Антитела там уже в изрядно разведенном виде. Если понизите титр- то стейнинг будет аховый.
Что же до фикс- перм- то, возможно, сменить протокол на "классику" с фиксацией в 2% PF в PBS и пермеабилизацией Твином или Сапонином, однако...все зависит от того, что красите.
Что же до фикс- перм- то, возможно, сменить протокол на "классику" с фиксацией в 2% PF в PBS и пермеабилизацией Твином или Сапонином, однако...все зависит от того, что красите.
Радимира, 11.11.2010 15:37
Если это существенно....красим всего-то FOXP3/CD25/CD4 (соответственно номерам ФЭУ) Фирменные антитела постоянно используем в меньшем объеме, окрашивание нормальное...
Дядя ФАКСер, 11.11.2010 15:44
В меньшем объеме пробы (с сохранением концентрации клеток на мл), с пропорциональным уменьшением количества антитела- это ок. Но, тут есть другой питфолл: может быть недостаточно клеток для того, чтобы набрать необходимое число событий для статистики (хорошим тоном для Tregs считается набрать как минимум 100000 событий в FS-SSLymph - CD3+ gate, т .е. - не менее 1-5000 СD3+ CD4+CD25+high Foxp3+).
guest: Василий , 11.02.2011 14:34
хотел бы поинтересоваться у отписавшихся выше по поводу количественного подсчета все тех же Трег
Как считать правильнее: для каждого образца использовать изотипический контроль к anti-Foxp3 и вычитать из результата FOXP3-положительных событий при гейтировании области по CD4+CD25+, или же (как предлагает, к примеру, Miltenyi) максимально минимизировать неспецифику (все процедуры на льду, рабочий буфер с BSA, а так же FcR blocking reagent) и считать кол-во CD25+Foxp3+, выбранных по гейту CD4+?
Забанее спасибо
Как считать правильнее: для каждого образца использовать изотипический контроль к anti-Foxp3 и вычитать из результата FOXP3-положительных событий при гейтировании области по CD4+CD25+, или же (как предлагает, к примеру, Miltenyi) максимально минимизировать неспецифику (все процедуры на льду, рабочий буфер с BSA, а так же FcR blocking reagent) и считать кол-во CD25+Foxp3+, выбранных по гейту CD4+?
Забанее спасибо
Дядя ФАКСер, 11.02.2011 16:40
Второе.
belyachok, 03.03.2011 00:10
Добрый день! У меня также возникла проблема с внутриклеточными/внктриядерными антигенами. Я сама новичок, занимаюсь рутиной в иммунофенотипировании гемобластозов. А проблема моя в использовании реактива CyclinD1(в наборе с изотипич.контролем от BD) Нашла какие-то безумные старые инструкции с фиксацией спиртом, заморозкой и т.д. Но решила попробовать обычный Fix и Perm Solution (BDшные) со всеми необходимыми отмывками. Изотипический контроль прошел идеально, а вот сам cyclin d1(FITC) засветил все неспецификой. У меня там вырисовывается атипичный вариант лимфомы, но мне надо исключить зону мантии для диф.диагностики.
Например, как и циклин, внутриядерный TdT вполне нормально идет таким путем! В чем тут изюмина?
Например, как и циклин, внутриядерный TdT вполне нормально идет таким путем! В чем тут изюмина?
Дядя ФАКСер, 27.10.2011 20:59
Сколько лет антителам?
К тому же, Fix/Perm кит от BD.что для цитокинов, не особо подходит длявнутриядерных маркеров.
К тому же, Fix/Perm кит от BD.что для цитокинов, не особо подходит длявнутриядерных маркеров.
Sharu, 31.10.2011 15:00
(Larifa @ 14.03.2010 12:21)
Добрый день!Иммуноцитофлуоресцентная микроскопия не дает достоверных результатов
Думаете если вы свою чачу в дорогой белый ящик засуните, то он вам там все сам достоверно померит.
Ошибаетесь 
Для этого надо чтоб у вас сначала все на микроскопии идеально четко было, а потом можно и на цитометре условия подбирать. Насчет окраски на внутриклеточные антигены:
1. сначала фиксирую 1-2% параформальдегида на 10-15 мин при комн. темп. Очень важно не передерживать! Как раз от этого FS и SS падает! Хорошо отмываю и/или блокирую NH4Cl - иначе реакционные концы альдегида остаются и вылазит неспецифика.
2. только потом пермиабилизирую Perm/Wash буфером. Можно Tween, можно Triton, от этого результат не сильно хуже, главное без фанатизму. Крашу в этом же буф. с 1-2% БСА.
3. Отмываю тоже Perm/Wash.
Открутки 600xg для живых клеток и 1200xg для фиксированных 3 мин. на угловом роторе типа miniSpin потом переворачиваю пробирки как научил Леонид (ему респект за это
) и еще 1 мин. Иногда бывает нужно для живых по-нежнее, 400xg.Особо ничего не теряется, клетки сохраняют морфологию, размер исходную окраску. Хорошо красятся на внутриклеточн. антигены.
Guest, 28.11.2011 21:05
Отцы!
столкнулся с такой ситуацией: после пробоподготовки на внутриклеточное окрашивание (кит от Милтени, все в точности по протоколу) получаю идеальную картинку, НО после 5-10мин пребывания пробирки при комнатной температуре сигнал от флюорохрома, коньюгированного с антителами к внутриклеточному антигену падает практически в негатив. Сигнал от проверхностных красителей не меняется. Т.е. будто внутриклеточные АТ вываливаются из клеток. При этом картина по сайд скатер за этот промежуток времени не меняется.
Меня волнует воспроизводимость- можно с интервалом в 2-3 мин промерить несколько раз образец из одной пробирки, и все результаты будут отличаться (постепенное снижение сигнала).
Раньше использовал кит от еБиосаинс- вроде такого не наблюдал
Так и должно быть?
столкнулся с такой ситуацией: после пробоподготовки на внутриклеточное окрашивание (кит от Милтени, все в точности по протоколу) получаю идеальную картинку, НО после 5-10мин пребывания пробирки при комнатной температуре сигнал от флюорохрома, коньюгированного с антителами к внутриклеточному антигену падает практически в негатив. Сигнал от проверхностных красителей не меняется. Т.е. будто внутриклеточные АТ вываливаются из клеток. При этом картина по сайд скатер за этот промежуток времени не меняется.
Меня волнует воспроизводимость- можно с интервалом в 2-3 мин промерить несколько раз образец из одной пробирки, и все результаты будут отличаться (постепенное снижение сигнала).
Раньше использовал кит от еБиосаинс- вроде такого не наблюдал
Так и должно быть?
Дядя ФАКСер, 28.11.2011 21:39
Держите образцы на тающем льду, в закрытой коробке/прикрытыми фольгой.
Какое антитело/коньюгат и какие клетки?
Какое антитело/коньюгат и какие клетки?
Guest, 28.11.2011 23:12
Трег, антиFxop3 -PE
в принципе есть возможность в штативе холодном подавать обазцы
просто удивился что в мануале это не прописано (т.е. что измерять сразу после пробоподготовки)
ну и подобные анализы делаю достаточно давно, но раньше результаты особо не плавали (киты от еБиосаинс и двухкомпонентный инвитроген интрапреп)
в принципе есть возможность в штативе холодном подавать обазцы
просто удивился что в мануале это не прописано (т.е. что измерять сразу после пробоподготовки)
ну и подобные анализы делаю достаточно давно, но раньше результаты особо не плавали (киты от еБиосаинс и двухкомпонентный инвитроген интрапреп)
Дядя ФАКСер, 29.11.2011 14:59
Надо попробовать.
Если проблема сохранится, значит с китом траблы.
Если проблема сохранится, значит с китом траблы.
Guest, 29.11.2011 16:55
(Guest @ 28.11.2011 21:05)
сигнал от флюорохрома, коньюгированного с антителами к внутриклеточному антигену падает практически в негатив. попробуйте пост-фиксацию на холоду.
т.е после окрашивания еще раз PFA 1%
но вообще случай какой-то дикий. У Вас там никто лампы УФ не забывает в боксе тушить?
Такой впечатление что это не АТ вываливается (это то с чем можно бороться вторичной фиксацией), а флюорохром распадается. Попробуйте работать в почти полной темноте, как в фотокомнате. С красной лампой, чтоб шишек не набить себе и пробиркам
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.