Вы я так понял, сами Taq варите. Ко мне в руки попаля плазмида с Taq и очень хотелось бы с Вами как нибудь связаться по причине некоторых вопросов, связанных с наработкой . Если найдете свободную минутку отпишите пожалуйста на адрес kondratov@lin.irk.ru.
С уважением Илья Кондратов, н.с. лаб. Биоорганической химии
ЛИН СО РАН.

Да-да, завтра будет методика, напишу, вообще там всё тупо, просто кипячение.

http://molbiol.ru/protocol/18_02.html

Вы чего? Я бы стал так выделять - умер бы точно. всё, меня уже нет, завтра...

Да нет, Вы не совсем так меня поняли. У меня загвоздка в колячем штамме. А про саму плазмидку опять же ничего практически неизвестно, кроме того, что сперли ее из Англии где то в году 90-93.
Пробовал экспрессировать в XL1B и DH5alpha, но выхлоп слабоват.
Разжился на днях BL21, но он как на зло не трансформируется никак, зато контрольные плазмиды всасывает со свистом.
А про выделение, дык чистота меня не сильно интересует, в лабе все работают с вирусями и эукориотами. Я тоже просто кипячу с мылом и PMSF, но вашу методу посмотреть тоже очень хотелось бы.
По той методе, что у меня в руках, всю эту чачу еще и переосадить надо сернокислым аммонием, а потом ессно отдиализовать, но я этого не делал, лизат тупо заливал глицерином 1/3 объёма. Пробные партии фермента прекрасно работают уже 2 месяца.
Вопрос таков: в чем вы экспрессировали и как выделяли.
С уважением И.К.

Ээээ, так у меня был и есть штамм... В Вашем случае экспериментировать можно долго - надо знать что там за промотор всё-таки точно. А то 90-93 это наверняка или Lac или Tac или вообще экзотика, просеквенировать бы с 5'-конца полимеразки в сторону промотора. А то вдруг там барахло типа триптофанового промотора или транкейшн какой... Плазмида-то какого размера? Устойчивость какая? Что касается нетрансформации BL21, то сие странно. Но не зная индуктора (чего там - ИПТГ стандартный или что) ничего сказать не могу. Если ИПТГ, Вы трансформанты на глюкозу высеваете или как?

Читать мне естественно лениво, в предыдущих случаях ее уже экспрессировали в Novoblue и индуцировали IPTG, все было оК. Что касается трансформации то мажу я на чашки с Terrific Broth с ампициллином и 2% глюкозой. А как иначе-то?
Сама плазмида ~6-7 kB, и то на "глаз".
Сейчас на руках у меня есть XL1B, DH5a, C600, TG1, TG2, HB101,
Jm103, JM109, MH1 и тот самый "заколдованный" BL21. Дык вот, куда трансформировать то? Может чего подскажите, может кто из знакомых развлекался?
И кстати, что у Вас за штамм. Может достать смогу как-то.
Да, и методу по выделению обещали'с.....
И.К.

to Veshka:
Все-таки, хотя тема и увяла, было бы очень интересно, если бы вы смогли привести обещанную методику выделения. Меня как раз волнует возможность относительно просто выделить Taq. Можно на мыло: symonenko@rbcmail.ru. Заранее спасибо.

[ 12.04.2004, 14:47: Сообщение отредактировано: A.V.S. ]