Научите, как нужно разрушить клетки животного, культивируется монослоем, для последующего определения общего белка?

Снять клетки, если возможно - без трипсина, если трипсинить - то его надо потом отмыть. В буфер добавить ДНКазу, клетки ресуспендировать, набрать в шприц и быстро пропустить через нетолстую иглу. Вываливающаяся из ядер ДНК может быть настолько вязкой, что после разрушения клеток раствор на некоторое время может стать непипетируемым, но ДНКаза через некоторое время сработает, и тогда можно отбирать аликвоты для определения белка. Можно также ультразвуком, чтобы не учитывать поправку на белок, добавленный в виде ДНКазы (и трипсина).

Спасибо, что трипсин -белок я как-то забыла, но не догнала причем тут ДНКаза?

Вам же написал Митин - дабы не получить "соплю" в пробирке. ИМХО, ультразвуком попроще будет.

Оно, конечно проще, но если нет ультразвука, наверное можно снять трипсином, отмыть от него хотя бы физ.раствором и разрушить замораживанием -оттаиванием, но при скольки оборотах и сколько открутить по времени, и можно ли определить концентрацию белка по биуретовой реакции, а не по Лоури (ну бедный у нас институт, ну нет у него денег на реактивы). В общем, голь на выдумки хитра.

Будьте проще, коллеги!
Наливаете в чашку лизирующий буфер, ставите на лёд на 5 минут и отскребаете скребком все клетки. Затем собираете дозатором, центрифугируете и измеряете белок в супернатанте. Про ДНК не переживайте, если лизирующий буфер без ДСН, то днк не вывалится. Однако, какие белки вы исследуете? Если ядерные, то дсн и днказа (BENZONAZE - нуклеаза широкого спектра действия)обязательны в составе лиз. буфера, а если цитоплазматические то хватит Тх100. Посмотрите в нете состав RIPA буфера для цитоплазматических белков. Не забудьте про ингибиторы протеаз!
Самый простой буфер:
NaCl 50mM
EDTA 5mM
Tx100 1%
Tris-HCl pH 7,5 20 mM
Protease Inhibitors Cocktail
если интересуют ядерные белки, то добавить:
SDS 0.5%
DOC 1%
Benzonaze

Спасибо за совет, исследую цитоплазматические белки, не могли бы Вы подсказать при скольки оборотах и какое время фуговать?

Дурацкий вопрос, ибо
1) Неизвестно, что за клетки
2)- и самое важное- неизвестен диаметр ротора центрфуги

5 минут на максимуме микроцентрифуги.

Спасибо

а просто гопотоническим раствором или дистиллированной водой (осмотрическим шоком) разве не реально разрушить клеточную мембрану? плюс можно добавить glass beads и на шейкер, ну кончено в присутствии ингибиторов протеаз. тогда никакие денаутраты не будут мешать определению общего белка... мы после такой процедуры используем Брэдфорд

"гопотонический раствор" - безусловно в мемориз!!! Я понимаю, что описка, но какая жирная фраза!!!