Здравствуйте, уважаемые форумчане! Вот решил заняться выращиванием светящихся бактерий в домашних условиях. Прочитал, что легче всего выделить чистую культуру P. phosphoreum(она же и самая яркая). Достаточно оставить в холодильнике на несколько дней свежую морскую рыбу или кальмара, залитого 3% раствором NaCl, и потом произвести с него посевы. Так и сделал: купил 2 кальмара, наполовину залил их в контейнере и поставил в холодильник. Через сутки было замечено большое кол-во светящихся(в темноте) точек на поверхности кальмаров(до 1 мм). Тут же была сварена селедка на 250 гр.(доварил до 200 мл раствора). Раствор процедил через ватный фильтр, снова нагрел и добавил 4 гр. пищевого агара и 6 гр. поваренной соли. Разлил все это дело в чашки Петри, подождал пока остынет и стерилизовал в скороварке 40 мин. Пептон, к сожалению, не знаю, где достать(живу в Литве), да и дорогой он наверное будет, если у нас стеклянные чашки Петри стоят где-то по 40 рублей за штуку(примерно). Посев проводил в самодельном главбоксе(занимаюсь еще выращиванием мицелия вешенки весьма успешно). Сеял в 3 чашки Петри методом истощающих посевов самодельной инокуляционной петлей(спица с концом, загнутым на 90 гр). Потом еще сделал посев в нестерильную бутылочку с 10% фруктозой и 3% раствором соли. Оптимум температуры для этой бактерии +18-20, при +30 они уже не растут. Инкубировал в холодильнике(у меня там +10 в связи с жарой, но продукты не портятся, т.к. быстро съедаются)). В течении 2 дней вообще ничего не росло(хотя на кальмарах выросло за сутки), потом стала расти очень слабосветящаяся слизь, даже не сравнить по светимости с кальмарами. Причем отдельных колоний не наблюдалось, а в последней чашке только 2 пятна по 3 мм. Жидкость в бутылочке помутнела и стала слабо светиться(заметно только в полной темноте). Вот информация, которой руководствовался:
на русском:
http://www.maikonline.com/maik/showArticle...GFEML〈=ru
http://dic.academic.ru/dic.nsf/dic_microbi...%80%D0%B8%D0%B8
http://dic.academic.ru/dic.nsf/brokgauz_ef...%80%D0%B8%D0%B8
на английском:
Vibrio phosphoreum isolation protocol: http://www.disknet.com/indiana_biolab/b203.htm

Из одной английской энциклопедии: http://en.citizendium.org/wiki/Photobacterium_phosphoreum

Рецепты сред для свет. бактерий: http://www.biology.pl/bakterie_sw/bac_pod_en.html

Про них из книжки Левенгука:
Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford, 1927
(Synonyms : Micrococcus phosphoreus Cohn, I 878 ; Bacillusphosphorescens I1 Baumgarten,
I 888 ; Photobacterium phosphorescens Beijerinck, I 889 ; Bacillus hermesi Trevisan,
I 889; Streptococcus phosphoreus (Cohn) Trevisan, I 889; Bacillus phosphoreus
(Cohn) Mack, I 901 ; Photobacter phosphorescens Beijerinck, 1901 ; Pseudomonas
lucifera Molisch, 1904 ; Bacterium phosphoreum (Cohn) Molisch, I 9 I 2 ; Photobacter
phosphoreum (Cohn) Beijerinck, I 9 I 6 ; Micrococcus physiculus Kishitani, 1930 ; Coccobacillus
acropoma Yasaki & Haneda, I 936 ; Coccobacillus macrouri; Acinetobacter
phosphorescens Brisou, I 955 ; Photobacterium profundum Weisglass & Gavrilovic,
Short rods or coccobacilli 1.0 to 2-5 x 0.4 to 1.0 pm., occurring singly and occasionally
in pairs, axis straight. Motile by a single polar flagellum, but only a small proportion
of the cells in a culture are observed in motion. In stained specimens many
pleomorphic cells are observed and polar staining frequently occurs. Gram-negative.
Sea-water agar colonies : Off-white, translucent, circular, convex, entire margin,
smooth, shiny, I to 2 mm. diameter. Luminous I to 3 days. Moderately good growth.
Sea-water broth : Moderately good growth, ring of dense growth at surface, slight
uniform turbidity, granular deposit.
1963.) No growth at 37", most strains grow at 5". Growth and visible light usually emitted in media containing 0.5 to 5 % NaCl. No growth in 7,5 %' NaCl or without NaCl.
Growth at pH 6 to pH 9.
Aerobic, facultatively anaerobic.
Sensitive to chloramphenicol, streptomycin, polymyxin B and 2,4-diamino-6,7-
diisopropyl pteridine ; sensitivity to terramycin and aureomycin is variable. Insensitive to penicillin. Nitrite produced from nitrate, acetylmethylcarbinol and 2,3-butanediol produced,
ammonia produced from peptone, trimethylamine oxide reduced to trimethylamine.
Indole not produced. Methyl red test positive.
Oxidase-negative, catalase-positive.
Usually produces alkaline products from arginine and possesses a lysine decarboxy-
Tweens 20 and 40 occasionally hydrolysed, Tweens 60 and 80 not hydrolysed.
No opalescence or free fatty acids produced on egg yolk agar.
Gelatin not usually liquefied.
Starch not hydrolysed.
Chitin usually digested.
Acid and usually gas formed in glucose, fructose, galactose, mannose and maltose
and occasionally in ribose and fucose. No acid or gas formed in arabinose, rhamnose,
xylose, lactose, sucrose, sorbose, cellobiose, trehalose, raffinose, cellulose, mannitol, dulcitol, glycerol, sorbitol, inositol, dextrin, salicin, inulin, laminarin, starch or glycogen. lase but does not possess an ornithine decarboxylase.
Metabolism of carbohydrates fermentative.
DNA base ratio 39.0 to 42.0 moles % G+C.
Habitat: Sea water.


Теперь собственно вопросы. Почему не получилось отдельных колоний и все так медленно росло(ведь на кальмаре выросло за сутки)? Здесь я грешу на питательную среду(слишком непитательна, ведь обычно выращивают на мясо-пептонном агаре). Возможно кто-то сталкивался с похожими по характеристикам бактериями и может предложить питательную среду без пептона, которую легко приготовить в домашних условиях? Думаю делать посев из бутылочки с фруктозой на среду из настоя фарша. Как это лучше сделать, чтобы были отдельные колонии? Возможно ли приготовить селективную среду для этих бактерий в домашних условиях? По материалам они нечувствительны к пенициллину, могут расти на глюкозе и в 5% растворе хлорида натрия, наблюдается медленный рост при +4 цельсия. Есть задумка подсластить мясной бульон глюкозой, но прочитал, что глюкоза реагирует при +100 с белками. Чревато ли это потерей питательности? Какую концентрацию лучше сделать? Теперь про стерильность: обязательно ли воздух должен быть стерилен при посевах? Надеюсь не завалил вопросами , все таки первый раз работаю с бактериями. Очень рассчитываю на вашу помощь.
Заранее огромное спасибо!

P.S. Вот фото:

Первая чашка Петри:


Последняя:



Бутылочка:


Примечание: маленькие точки в агаре(может казаться, что на поверхности) - хлопья, образовавшиеся после стерилизации, а не колонии бактерий. Здесь бактерии растут только одной массой.

P. P. S. Как вообще приготовить универсальную питательную среду для бактерий(типа мясо-пептонного агара, но без пептона) в домашних условиях? Здесь кто-то упоминал, что E.Coli растет на "минералке с глюкозой". Хотелось бы узнать состав и концентрацию этой среды(не смог найти в интернете). Еще раз спасибо!

А на чашке они светятся?
http://www.google.com/images?q=phosphoreum...iw=1280&bih=612

Светятся, но очень очень слабо(заметить можно только в полностью темной комнате, когда глаза привыкнут к темноте), наверное, потому что в этой слизи растет много посторонних бактерий. К тому же, чтобы сфотографировать биолюминесценцию нужна длительная выдержка, а у меня максимум 4 секунды на фотике. Да и чистые колонии на агаре светятся не более 3 дней, а у меня эта слизь стала расти только на 3 сутки после посева, до этого вообще не было свечения Зато как на кальмаре ярко светились! Пожалел, что не могу сфоткать...

В статье, которую реферировала их выращивали в NaCl 30 g/L, Glycerol 3 ml/L, Difco Casitone 5 g/L, Difco Yeast 133 Extract 3 g/L, KH2PO4 1.179 g/L, Na2HPO4·2H2O 5.395 g/L

выращивали с аэрацией, около 22 и максимальное свечение было после достижения культурой стационарной фазы, что напоминает нам о quorum sensing, глюкозу я бы не стала, не исключено, что глюкоза выключит свечение, хотя точно регуляцию я и не помню, но что-то такое вспоминается. Ну или вырастить с глюкозой, отмыть клетки и продолжить растить уже без глюкозы, что в домашних условиях затруднительно.

Короче, докладывайте о процессе. Кстати, интересно, будут кусочки кальмара активировать свечение или нет.

Спасибо за рецепт среды! Можно ссылку на статью, если есть в инете? Благодарен за предупреждение, значит глюкозу не буду добавлять, пока не выделю чистой культуры, а то как потом разберешься, где нужные колонии, а где нет. Это кусочки кальмара добавлять в среду? Впрочем, я планирую приготовить среду из осьминогов: их у нас сбывали в одном магазине(по-другому не назовешь). Были 27 lt/кг(примерно 270 рублей или 12$), стали 6 lt/кг(около 3$). Ясно, что уже с истекшим сроком годности, но для среды, я думаю, будут по-питательнее мясного фарша и дешевле. А может их вообще не понадобиться, родные через несколько дней приедут из Белоруссии, я им сказал поспрашивать в аптеках Аминопептид(может использоваться, как заменитель пептона) и казеиновый гидролизат. Вот только никак не могу понять, обязательно ли делать посевы в стерильном воздухе? Ведь в воздухе полно спор бактерий и плесневых грибов, но в мануалах я не нашел об этом упоминания, там говориться только, что надо стерилизовать среду.

О процессе обязательно буду докладывать! Только вот его продолжение будет через несколько дней с Аминопептидом или осьминогами

Пространство в радиусе 15 см от открытого огня, свечки, спиртовки, горелки, условно считается стерильной зоной.
Ссылки пока нет, но состав, имхо, стандартный для морских бактерий.

Премного благодарен! Наконец-то мои сомнения развенчаны!

Получилось в итоге вырастить изолированные колонии?