Пробую мерить Ca на FC500 с помощью fluo-4AM Invitriogen в суспензионных культурах. Но столкнулся с такой проблемой: после создания базовой линии, в то время когда добавляю стимулятор, и пробирка ездит-туда обратно (время удалось сократить до 10 сек), цитометр продолжает отчитывать время, создавая на шкале время пустое пространство. это мешает мне при анализе файлов в программе flowjo 7.5. Да, еще не получается титр по концентрации стимулятора (aCD3, ionomycin, PHA). Либо сильный ответ либо никакого. Что посоветуете?

Кнопку "pause" во время забора семпла не пробовали нажимать? Должно счетчик времени останавливать.

Нажимаю кнопку "pause" с круглой стрелкой, что позволяет пробирке подъезжать к окошку для дальнейших манипуляций.

И? Таймер продолжает отсчелкивать?
Хотя, ЕМНИП, что-то припоминаю из кривостей управлябщего софта данной машины.

Продолжает зараза

может в этом софте есть опция для анализа дот блотов с time, но я не нашел

Поройтесь в настройках. Я с FC500 Работал только эпизодически и, последний раз- года 4 назад, так что всех тонкостей софта оной модели не помню. Особенно, если машина- с "каруселькой" (CS вариант у вас стоит, как я понимаю?)
Вот в DiVa или Expo32 пауза работает корректно- таймер стопится.

Спасибо, сейчас попробую просто паузу нажать. Да, с каруселькой.

Не получилось - при любых вариантах таймер идет, но очень сильно надеюсь, что где-то есть там какая-то секретно - волшебная галочка.

Хм...Хотя, с другйо стороны- а что это меняет? Файл- единый, бейзлайн записали, сигнал- тоже. Будет картинка с "ямой"- и что такого? Чем она мешает то? "Склеите" потом, али интерполяцию-экстраполяцию проведете.

flowjo 7.5. эту яму воспринимает неадекватно и рисует огромный скачек. Может быть другие программы есть?

Видимо придется на спектрофотометре мерить

На флуоресцентном ридере т.е.

Вчера сделал дот блот по FL1 log и FS - получил две четкие популяции (падения флуоресценции со временем не было - 360 сек): отвечающих и не отвечающих на стимуляцию клеток (PBMC). там где не было красителя в первой популяции ноль %, где нет стимула, но есть краситель 2,5-3 %, со стимулом (PHA) увеличение популяции от 10 до 40% по мере возрастания концентрации PHA. Можно ли таким образом предоставлять данные? Мне кажется, что около 100% должны были ответить - так было на Jurkat с aCD3, но там в течение 100 секунд сигнал упал до базального.

Флоуджо 7.5 под Win? Она кривая.
Скачайте FCS Express 3.0

P.S. 100% ответа у PBMC не бывает- гетерогенная популяция, однако.

Или прозе "лекарство"- сделайте на дотплоте Time VS FL два гейта (исключив провал), потом gate out на два отдельных дотплота, а потом- склейку данных.

спасибо! сейчас попробую, а FCS Express вроде платный?

Личку проверьте.

Для решения этой проблемы в ряде лабораторий у нас применяют «леонидову пендюрку n 2».
Фотографии нет, поэтому опишу на словах.

1. Берётся «леонидова пендюрка n 1», сиречь переходник для эппендорфов, состоящий из верхней половинки обычной факсовой пробирки FALCON 352058 в которую вклеен «так чтоб торчало» кусочек силиконового шланга, на который, собственно и надевается эппендорф с образцом.

2. В самый верх силикового шланга, так чтоб не мешала надеванию эппендорфа, продевается загнутая буквой «Г» тоненькая и короткая игла для шприца. Таким образом из пендюрки горизонтально торчит шприцовый переходник иглы острие которой внутри «пендюрки» направлено в сторону образца (параллельно зонду цитометра).

3. Пендюрка надевается на цитометр, вставляется шприц на 1 мл заправленный 0.1 мл стимулятора.

4. Надеваем эппендорф и пишем базовую линию.

4. Лёгким и изящным движением руки нажимаем на поршень шприца и впрыскиваем в систему стимулятор без какой-либо остановки системы

5. Продолжаем измерения, записывая «кальциевый ответ».

6. Публикуем. (в Nature, само-собой )

например http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pi...6749(05)04083-2
Fig 3A
(легко видеть, что никакой паузы в измерениях нет)

Сурово

да ладно Вам.
Главное сделать «пендюрку n 1». A уж воткнуть в нея иголочку - проще пареной репы. У нас уже весь факультет почти на эппендорфы перешел. Бедный Falcon ... никто не покупает его пробирочек.

Жаль, что нет фото этого шедевра!

неужто красноречие моё не заменяет фото? Нет, оно, конечно «Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать, но что именно не понятно?

Возьмите в руку стандартную FACS-пробирку, эппендорф и подумайте. «Пендюрка n 1» изготовляется за 15 минут с учётом перерыва на кофе и перекур посреди работы.
«П n 2» изготовляется за 1 минуту ...

Хм, а в чем цимес работы с эппендорфами то? Мне удобнее с фальконками, али с планшетами (если HTS-option под рукой).
Разве что только на какой-нить эффект в быстрой кинетике смотреть (чтобы вколоть вещество непосредственно в семпл)...

"Нет, оно, конечно «Лучше один раз увидеть, чем сто раз услышать, но что именно не понятно?"
Попробую объяснить как понял строение «леонидовой пендюрки n 1»: цитометровская пробирка разрезается пополам, в верхную часть с внутренней стороны приклеивается силиконовый шланг. В верхний конец шланга вставляется загнутая на дно пробирки игла, снизу - эппендорф - так чтобы нижний конец шланга был в образце.
Если это так, то непонятно зачем в этой конструкции эппендорф, можно было просто шланг и пробирка, - видимо неправильно понял конструкцию.
Простите за навязчивость.

Понял зачем epp - чтобы менять образцы!

В современном софте ( и на современных цитометрах) есть такая функция- "append"

Сделал пробную пендюрку. Единственный минус, который раньше был всегда плюсом - карусель. Шприц будет там свободно ездить.

Да, всё правильно.
Вы в какой-то степени собираете обычную цитометрическую пробирку из трёх частей: половинки пробирки, кусочка шланга, эппендорфа.
Верхняя часть всегда сидит на цитометре.
Шланг позволяет герметично одеть эппендорф, т.е. является переходником.
В эппендорфе - образец.

1. цена
2. удобство центрифугирования образцов (особенно фиксированных, когда нужно повысить обороты, на эпп-центрифуге это быстрее и проще)
3. По мелочи ... например, после отсасывания супера после крутки ресуспендирование клеточного осадка в эппендорфе это один решительный бррррум по воздухозаборной решетке ламинара. С цитометрической пробиркой этот фокус не проходит. Осадок собирается в мелкую кучку на дне, его лучше видно итд итп.

Но если есть вольготность в бюджете, то с эппендорфами можно не заморачиваться. Но даже в этом случае эппендорфы удобнее, компактнее etc.

И клетки лучше после отмывок в epp, меньше потерь и дебриса

Когда у тебя в семпле мало клеток- это имеет смысл, когда 5-10-15-20 миллионов- фальконы удобнее.

не, ну когда 10 млн то в эпп это уже не образец а манная каша из клеток. Конечно речь идёт о небольших количествах

Это- образец, когда , к примеру, Ki67+ iNKT смотришь в периферической крови