Уважаемые коллеги!
подскажите в чем может быть проблема.
Ситуация: есть МНК человека и есть антитела к рецепторам цитокина, меченные фикоэритрином. Поскольку в дальнейшем развитии анализа предполагается оценка абсолютного количества рецепторов на клетке с использованием калибровочных бус, было необходимо оценить точное количество антител, которые нужно добавлять к клеткам. Ранешняя титровка антител BD показывала хорошую кривую с выходом на плато, а тут...
В результате, чем больше мы добавляем антител, тем больше получается позитивных клеток с большей средней mean...
Что в моем понимании таки неправильно, потому что насыщаемость рецепторов антителами должна быть все таки конечной... А мы увеличили дозу рекомендованную производителем (R@D) уже в 8 раз...

Какие могут причины?

P/S/ не делали блокированием Fc-рецепторов перед мечением, насколько это может быть принципиальным?

блокирование Fc-R обязательно

блокирование неспецифики (БСА и проче колдовство) - очень желательно

отсеивание случайно продырявленных КЛ - желательно (SYTOX Green - только не забудьте откомпенсировать на всякий случай)

инкубация на холоду относительно продолжительное время, 60 мин, например, может дать результаты лучше, чем комн. темп. В редких случаях может всё испортить (связывание падает в разы)

Раститровка- monkey's business, ибо производители и так разбавленные стоки поставляют.

Можно ли использовать 7AAD ? И что это даст относительно увеличения позитивных клеток?


Дядя Факсер, а почему мартышкин бизнесс? Для антител BD мы стандартно проверяем что при уменьшении или увеличении дозы в 2 раза не изменяется ни количество позитивных клеток, ни средняя флуореценции...
А с этими антителами разница оочень ощутимая.
Пример: %позитивных клеток в популяции CD19
5мкл Ат - 9,8%
10мкл АТ -14,6%
20мкл АТ - 21,6%
40мкл Ат -37,4%
80мкл Ат -48,7%

Доза рекомедуемая производителем 10мкл....

Просто антитела- дрянь, коли такая неспецифика лезет. Санта Круз, что ли?

Да можно - и 7ADD, и PI- главное, чтобы в другие каналы не лезло.
Что даст? Даст отсев дохляка (в дополнении к морфологии).

Антитела фирмы R@D. :-(

Использование сыворотки 4 группы, как я понимаю в данном случае противопоказано, поскольку антитела к цитокину, который в сыворотке есть! Тогда получается использовать для блокирования FcR только чистый IgG?
Корифеи подскажите, вы такое правда делаете, перед каждым анализом?
Или может где то можно купить чистые иммуноглобулины дешевле? А то мы покупали его для стандартов по такой весьма нескромной цене 6-)

чего то я не понял: что Вы детектируете?
У Вас- сугубо поверхностное окрашивание, если антитела хорошие- то достаточно использовать PBS+1%BSA в качестве буфера на всех стадиях.
Если же нет уверенности- то да, FcBlock перед окрашиванием (15-20 минут инкубации, без отмывки)

P.S. Для коньюгатов не используются цельные иммуноглобулины, только- Fab-фрагменты