Настя, поясните, пожалуйста, чайнику - можно ли данные КД использовать для построения трехмерной структуры белка и почему. Давайте порассуждаем, если есть время.

у нее нет времени
А ответ, нет, нельзя

Ну, сами по себе очевидно нет, но как вспомогательный материал? Используют же карты "Рамачандрана энд Ко" кристаллографы, а они ведь ничего кроме "разрешенных" углов не дают.

Можно эти данные использовать для отбора структур, полученных методом de novo. Или для проверки того что программы fold recognition нашли то что надо. В общем, конечно такие данные использовать можно, тем более что в некоторых редких случаях бывает даже непонятно, спиральный белок или складчатый.

А если есть возможность белок нагревать и при этом снимать спектры, то будет еще больше интересной информации, которую можно сопоставлять с "нагревом" модели белка в молекулярной динамики.

как вспомогательный материал можно использовать все

Ну вот как делали нагревание белка и сопоставление с молдинамикой - это я лично наблюдала.

Такая возможность есть. Я имею ввиду снимать температурные спектры. Да и другие тоже.

У вас есть в загашнике краткое описание принципа de novo? Дайте, пожалуйста, ссылку или, если есть время, опишите сами. Только не талмуд, а прницип. Копать будем позже.

Т.е. вот такая сырая идея :
- получаем спектр белка при определенных условиях
- добиваемся конформационных изменений, снимаем спектры
- оцениваем по нескольким алгоритмам вторичные структуры
- оцениваем свободную энергию фолдинга.
- сводим это все для оценки модельной структуры, рассчитаной, скажем, de novo. Или используем для построения такой структуры.

Может этим кто-то уже занимается? Был бы рад поговорить со специалистом.

Можно подключить другие методы, если будет полезно

Принцип de novo такой: берем программу Rosetta (www.bakerlab.org), запускаем, когда она падает - запускаем еще раз, и так до тех пор пока не наберется несколько тысяч структур. Rosetta собирает структуру из маленьких кусочков фактически методом Монте-Карло.

Для белка вначале надо посмотреть, что говорят программы fold recognition, может для него модель можно легко построить. И уже после этого делать пункты 1-3 и 5 (пункт 4 довольно-таки бесполезный, потому что хороших методов оценки пока нет).

Ясно. Спасибо за ссылку. Какие параметры модели в результате выдаются программой? Если я, допустим, оценил по КД количество структур, я как-то могу отсеивать из нескольких тысяч моделей подходящие? Например, я оценил третичную структуру, как альфа-бета, и вторичные как 15-20% альфа, 25-30% бета. Это можно использовать?


Что вы подразумеваете под хорошими методами? Я имею ввиду, если нет хорошего метода, то как можно говорить, что метод плох...

КД фолдинга/рефолдинга белка с денатурантами и осмолитами годится или?

Rosetta выдает в результате третичную структуру, вторичную можно посчитать с помощью stride, проценты вторичной структур можно посчитать чем угодно.

Хороший метод оценки свободной энергии - это такой, который позволяет из множества моделей выделить наиболее правильные. Таких пока нет.

Насчет КД с денатуратами - точно сказать не могу, надо бы посмотреть, что об этом пишут, насколько оно похоже на КД с нагреванием.

У меня появилось ощущение взаимонепонимания. Наверное, я был неточен или чего-то не понимаю. Давайте, еще раз пройдемся с некоторым упрощением. Я имел ввиду:
А.
1. получаем реальный волновой спектр белка, скажем, от 190 до 260 при 20 С.
2. Оцениваем вторичную структуру по этому спектру с помощью известных алгоритмов. Например, из пакета CDpro.
3. Получаем оценку альфа, бета структур в процентах.

Б.
1. С помощью Rosetta получаем те несколько тысяч вариантов структур белка.

В.
Вопрос. Можно сортировать структуры из пункта Б1 по критериям оценки из пукта А3? Скажем, поставить граничные условия типа - в белке должно содержаться от 10 до 15% альфа и 20-23% бета.



Наверное, я тут смогу пояснить. Сама по себе температурная денатурация для вычисления свободной энергии фолдинга мало пригодна, потому что она чаще всего необратима - белки аггрегируют и не ренатурируют. Основным же требованием для определения свободной энергии является обратимость процесса.

Эта проблема обходится в случае с денатурирующими веществами типа мочевины. Фактически такой эксперимент - это построение кривой титрования. Правда, принцип расчетов СЭ несколько другой.

Наконец, можно температурно денатурировать в присутствии мочевины. Подбирается такая концентрация мочевины, чтобы белок был еще фолдирован, но уже на подходе, что называется. Белок уже плавится, аггрегаты еще не образуются, процесс может быть обратимым, свободную энергии можно вычислять.

Вот это последнее я не делал лично, но все в наших руках.

В - конечно можно, только я не знаю готовой программы для этого. Но задача сама по себе очень простая.

Температурная (или какая-то другая) денатурация нужна не для вычисления свободной энергии, а для определения того, как зависит спектр КД от степени денатурации белка, чтобы сопоставить с данными, полученными при "нагревании" модели белка путем молекулярной динамики.

С другой стороны, может быть у Вас модель белка и без таких вот сложностей построится.

денатурация мочевиной может быть столь же необратима, как и температурная, и то, что вы вернулись обратно в ту же точку фазовой кривой рефолдинга, оттитровав мочевину обратно, ещё нужно доказать объективными методами.

вообще, такими методами сейчас структуры не выясняют в первом приближении, для начальной точки и рабочей гипотезы о структуре используется моделирование методом поиска гомологов белка по первичной последовательности.

NMR-guy, ну, видимо, нету у белка гомологов. То есть не находятся.

тогда гомологи субдоменов и предсказатели 2-ичной структуры.

потом уже - попытка получить distance constrains или кристаллизация, затем - моделирование. или сборка из субдоменов структуры вручную.

топикстартер хочет притянув за уши изменение эллиптичности раствора белка к некоей структуре de novo заявить что он решил структуру. Я думаю, время таких подходов прошло вместе с 80-ми годами.

NMR-guy, почему эллиптичность-то? Процентное соотношение разной вторичной структуры же.

Конечно может быть необратима. Только что мне надо доказывать, если спектры в обе стороны совпадают? Для рассчета свободной энергии этого достаточно, насколько я понимаю. А она нужна мне не просто как картина на стену, что бы дырку закрыть, а, например, погонять условия влево-вправо вверх-вниз и посмотреть, что как это на белок влияет. Точнее на его свободную энергию. И вот еще хочу попробывать применить к моделированию, в котором пока не разбираюсь.


Ну да, не вопрос, пожалуйста, пускай выясняют подбором гомологов. Я и сам выясняю. Но что дает 10% гомология? А 20%? А если гомологов нет? Всегда у гомологов структуры совпадают? Ребята, которые только на гомологию опираются в первом приближении всегда рискуют пойти в неверном направлении. КД сразу дает возможность оценить белок. Чем не гомолог самому себе?

Мда. Нет слов. А вы с такими боретесь, я подозреваю. Но это уже флуд, то что вы думаете.

Neznika, опять Вы всуе упоминаете свободную энергию. Зачем? Какое отношение она будет иметь к спектрам?

Настя, это твое дело, конечно, но уровень топик стартера был очевиден с самого начала

А о наличии связывающего железо домена (похожего на фратаксин) в гемолизине II что-то опубликовано на английском?

К спектрам - пока не определился. А вот к модельной структуре - я уже выше упоминал. Как критерий отбора среди смоделированных Rosetta. Дополнительный параметр.

in proceedings only

google helps

Я не Настя, но отвечу: совершенно верно - именно в самом начале я определил себя как "чайник".

Согласна, твой глаз острее.

Извиняюсь, что вклиниваюсь в увлекательное обсуждение глаз.

Настя. Да. Вероятно, экспериментальная свободная энергия мало что дает в случае моделирования. Если предположить, что алгоритм подбора учитывает требование стабильности для свободной энергии -5- -15ккал/мол. Правда для натуральных белков.

Вот тут и про гомологичность и про КД. Может интересно будет. Мне кажется, это в русле разговора.

Design of highly stable functional GroEL minichaperones
Qinghua Wang, Ashley M. Buckle, Nicholas W. Foster, Christopher M. Johnson, Alan R. Fersht 1999

Бла-бла-бла.

"However, the possibility that the small negatively charged islands, found at the C-terminus, can be a part of bacterial iron uptake system should be checked experimentally."

Had it been checked within the last ... 4 years! OOO, you are so busy! With bla-bla-bla!

Energetics of protein folding.
Baldwin RL.
Department of Biochemistry, Beckman Center, Stanford University Medical Center, Stanford, CA 94305, USA. baldwinb@stanford.edu
Abstract
The energetics of protein folding determine the 3D structure of a folded protein. Knowledge of the energetics is needed to predict the 3D structure from the amino acid sequence or to modify the structure by protein engineering.

Короче, набрал тут статей, пошел читать. Определюсь и встретимся в понедельник. А то трудно так разговаривать. Одним нужна энергия, другим не нужна. "Не поймешь вас, Ивановых" (с)

Изя, знак волюты пишется перед числом. Общепринято.

Вот в валюте вы разбираетесь, а в моделировании как мои студенты 10 лет назад

Neznika, тот факт, что свободная энергия определяет структуру белков, в целом бесполезен для практического построения моделей. Для точного вычисления не хватает ресурсов, а для неточного совсем необязательно называть то, что вычисляется, громким словом "свободная энергия".

ну, а товарищ предлагает выяснять это отношение по измерению эллиптичности раствора на длинах волн 180-260 нм.
спектр эллиптичности потом разлагается в набор из 3 характеристических, и соотношение вроде как измерено объективно.

шаперонное влияние на свёртку - эт конечно всё интересно, но те белки, которые требуют шаперонов для свёртки обычно практического интереса не представляют, а если и представляют, то никому не придёт в голову моделировать их структуру де ново и опираться на их свободную энергию свёртки, сильно покорёженную в неизвестном направлении при контакте с шапероном.

я что хочу сказать, если поиск элементарных гомологов субдоменов из-за шаперонов бессмысленен, то ещё более бессмысленно проводить опыты титрования под контролем CD с такими белками - они гарантированно без шаперонов обратно нативный фолд не примут, и результаты измерения свободной энергии развёртывания в ходе частичной денатурации будут непубликабельны, так как очевидно что обратно оттитровать мочевину до нативного фолда белка в ней ничем без шаперона не удастся.

Хватит флудить тут. Иначе тему вытру, как исчерпавшую себя.

NMR-guy, а шапероны Вы к чему вспомнили? Вроде пока никто на них не жаловался.
Я думаю что топикстартер очень далек от реализации каких-либо новых революционных методов, поэтому можно его не предостерегать. А конкретных задач по определению белковой структуры у него нет.

Изя, уж не знаю о каких там студентах речь идет, потому что в моделировании может вы и разбираетесь, но читать, очевидно, не умеете.

Последний раз разжевываю вам лично, в двух словах: я - чайник в моделировании. ("Чайник" - новичок, человек не обладающий навыками и знаниями.)

С моделированием дела вообще не имел. Хочу понять, стоит ли связываться, что это мне даст по отношению к тому, что я имею. Поэтому обратился к Насте, одной из двух личностей, на мой взгляд, здесь, на форумах, настроенной на конструктивизм даже по отношению к дилетантам.

Не смею советовать, но если вам нечего сказать по-существу, не тратьте ваше время на меня. Займитесь вашими студентами или допишите те статьи, о которых вам кто-то выше пенял. Доказывать мне, что я дурак, когда я говорю, что я дурак - тупо.

что-то я разошелся.


Спасибо, Настя. Все правильно.


Подождите, Настя, подождите... Не понимаю. Речь идет об экпериментальном определении свободной энергии фолдинга. Причем здесь вычисления и нехватка ресурсов?


Ну, не совсем верно, но в принципе рядом. Т.е. вы согласны что КД даст объективную информацию о вторичной структуре?


согласен с Настей. К чему это?

Вам пока права обсуждать действия модераторов не предоставлено.

Та-а-ак. А у меня вопросы по
http://www.bionet.nsc.ru/meeting/bgrs_proc...2006_V1_052.pdf
Вопросы очевидные.
Вы взяли CyaY белок из семейства фратаксинов E.coli как гомологичную модель для построения C-части гемолизина. Очевидно, что Вы дальше придумываете его свойства как фратаксина. А что, других белков не нашлось?
To "estimate single chanel conductances of 6- and 8-meric channels" is NOT possible из Ваших моделей. "Это является спекуляцией." NMR-guy.

И explain пишется (не explane, in discussion), опечатки уже не исправите.

Кто читает просидинги... очепятки бывают везде, недавно перед отправкой выудили очень смешную - lower=lover
про conductances of 6- and 8-meric channels...

Между прочим, на следующий год после нашей в байофизик джорнал была статья, которая аналогичные два пика привязывала к стафилок. токсину... Мы может и могли бы что-то оценить, но кому оно надо...

Фратаксин всплыл совсем вслепую. Настя, вообще, еще ничего не знала о системе. В общем-то, большинство мест связывания железа в нем отсутствует, но оставшихся вполне достаточно. Гипотеза как гипотеза, вполне рабочая. Если учесть, что французы считают доказанным "народнохозяйственное" значение гемолизина, то ... Это пример вклада отечественной науки в французскую

Esya, try higher. Will write more later. What's the BiophysJ paper? А чего не проверите-то? Я зануден, Еся.
Французы меня не интересуют. Где мерили, не Вы же?

идите в личной переписке отношения выясняйте, последнее предупреждение, я уже озверел, следующие сообщения начну карать

статья по ссылке интересная, правил не нарушает, сам узнал много нового из неё.

я тоже за гомологичное моделирование, это - наш метод

Да, забыл предложить, если кто не сможет найти, открыть или скачать приводимые статьи - обращайтесь, пришлю.

to NMR-guy Да не карайте вы нас, воспользуйтесь правом не применять право - это только оживит дискуссию.

Тааак. Еся, а какaя-такая статья была? Скажите, pls:
"Между прочим, на следующий год после нашей в байофизик джорнал была статья, которая аналогичные два пика привязывала к стафилок. токсину... Мы может и могли бы что-то оценить, но кому оно надо... " А что Вы могли бы оценить, если Вы мерить "это" не умеете?

Насколько понимаю, про шапероны: они способствуют сворачиванию по одному из минимумов энергетических, что-то там говорил лет 10 назад Гвоздев про сворачивание в шаперонах как в бесконечно разбавленной среде.

И как Вы определяли, что связывается именно железо, а не никель, например, или Mg2+. Или редкий молибден, например, вместе с вольфрамом или Mn3+?

Может тему вообще перенести в "беседу", раз сюда приходят люди с целью поболтать?

Neznika, давайте Вы еще чего-нибудь прочитаете по моделированию, а я Вам потом на вопросы поотвечаю.

Еся не в Калифорнии, вроде бы. И её английский здесь - оффтопик. NMR-guy
http://www.bionet.nsc.ru/meeting/bgrs_proc...2006_V1_052.pdf
статья по применению нескольких подходов к гомологичному моделированию.

Упс, случайно не туда нажала, хотя и так нормально.
Эти тезисы я писала, кстати.

ОО, Настя же там как отвечающий аффтор! Что ответите, Настя? Начните с железа!

Я уже начала с сообщения модератору форума.

Он нормальный парень, все поймет. А правила не нарушены, потому что их нет просто

правила форума никто не отменял и тут. просто я сейчас вытру личные нападки, а статьи - весьма информативный источник того, какие ресурсы юзать и как результаты публиковать, потому они тут полезны.

explane - это да, странно. но к теме не относится.

NMR-guy

Нашел и прочитал лекцию некоего Тодаси Андо, научный университет Токио, 2006 года. Как я понял, речь в молекулярном моделировании идет о процессе самоорганизации, а не о конечном состоянии. Потенциальная энергия системы рассчитывается как сумма функций составляющих сил, то бишь взаимодействий, и определяется, опять же, набором координат атомов в пространсте. Точность расчета ограничивается временным лагом. Т.о. мы имеем какой-то набор потенциальных энергий за время процесса. Т.е. о внутренней энергии системы речь не идет. Хорошо. Т.е. плохо. Т.е. хорошо - как же определяется конечное, т.е. термодинамически равновесное состояние системы? Так ведь можно и промахнуть конечное состояние молекулы, если, предположим, для ее функциональной активности важно быть в несколько, т.с., нестаюильном стостоянии.

Еще побурчу. Опять же, как растворитель рассматривается вода, а реальности буферная система, не важно цитозоль это или фосфатный буфер - не вода. Это как-то учитывается?

Neznika, почитайте "физика белка", авторы Финкельштейн, Птицын.