Уважаемые коллеги, помогите с решением проблемы. Возможно, кто-нибудь уже сталкивался.

Задача: колонии гемопоэтических клеток из кордовой крови, полученные после культивирования в метилцеллюлозной среде MethoCult, нужно посмотреть на цитометре, дабы узнать - что именно там у нас выросло, то бишь: посмотреть разделение по субпопуляциям + добавить ГликофоринА и CD45.

Проблема: невозможно получить результаты: после снятия колоний с чашек Петри и отмывки от метилцеллюлозы в PBS на дотплотах нет разделения на субпопуляции (моноциты, гранулоциты...) как в случае крови или концентрата клеток. Но это еще полбеды: в последнем эксперименте на клетки не сели метки, то есть не было связывания с гликофорином и CD45. До этого была высокая аутофлуоресценция проб, так что увидеть ничего нельзя быо. В общем, провести адекватный анализ клеток из полученных колоний у нас не вышло.

Возможно, проблема заключается в вязкости метилцеллюлозы, которая обволакивает поверхность клеток даже после отмывки и таким образом экранирует рецепторы, препятствуя связыванию метки, но это мои домыслы. По поводу высокой аутофлуоресценции проб - может дело в самой среде. Говорят, что антибиотики дают высокую аутофлуоресценцию, но в MethoCult'е их вроде бы нет, а относительно флуоресценции самой метилцеллюлозы мне ничего не известно.

Если у кого-нибудь есть опыт решения подобной проблемы или мысли по этому поводу, пожалуйста отзовитесь.


Пожалуйста, используйте стандартный шрифт.

Хм, а смысл cord blood в Meth растить?

Насчет аутофлуоресценции- на чем меряете? Может просто вольтажи задраны?

Смысл в том, чтобы и колониеобразующую активность посмотреть, и состав этих самых колоний узнать: морфологии мало (не верит начальство моему глазику недонабитому). Потому и надо клетки из колоний на цитометре прогнать, чтобы доказать, что в BFU-E эритроциты, а в CFU-GM - гранулоциты.

О наращивании клеточной массы с использованием MethoCult никто не думал - среда ведь для определения колониеобразующей активности клеток (в т.ч. и клеток кордовой крови).

Аппарат наш - FACS Calibur.
Лично на нем не работаю - не доросло пока мое юное дарование до сего чуда техники , но коллеге передам.
По поводу вольтажей спасибо - учтем.

Но вообще основная проблема - это отсутствие разделения на субпопуляции после культивирования. Распределение клеток образует как бы "меч", и никаких популяций по FSC/SSC выделить не получается.

Первая полбеды характерна для большинства инвитровых исследований крови (изменение светоррассеивания в "культуральных" мононукларах приводит к затруднению их разделения по данным параметрам).

А вторая полбеды в том, что Вы похоже эритропоэз изучаете - а красные клетки обладают высокой аутофлюоресценцией.

Хотя... Может быть эту самую флюоресценцию и использовать во благо фенотипирования?

Чтобы Вам тут помогли нужно хотя ыб прибор на каком вы "снимаете" и состав флюорохромов в пробе.

Ой

Дык зачем тогда проточная цитометрия? ИГХ инситу не будет ли подтверждением вашему глазу?

MethoCult ничего конкретного про проточку не пишут к сожалению, только цитоспин и ПЦР анализ колоний.

Вот извращение.
Нет бы CFSE покрасить, прокулитивировать- а потом пролиферацию и дифференцировку по сабсетам и посмотреть.

Тут надобно лазер с умом выбирать. А на Калибуре сие- увы: только аргонка и краснуха. А на краснухе- всего 1 канал.

Само собой-это же не периферическая кровь. Да и все клетки застимулированные.
Морфология вам ничем не поможет в точном определении- только маркеры.
И нужна вам панелька...хм...цветов на 7+ dead +dump

Чтоб явно не-ядерные элементы от ядросодержащих клеток отсечь- DyeCycle юзать.

Трудно сказать что-либо определённое, когда не видишь результатов.

Пусть не будет обидно Вашему коллеге, но слово «меч» пугает. Похоже, что все клетки Вы потеряли в процессе отмывки, а «меч» это поток частиц и агрегатов. Сделайте контроль с PI, чтобы была уверенность, что точечки на экране клетки, а не Бог весть что. (не забудьте продырявить клетки сапонином)

Если «меч» действительно состоит из клеток, тогда будем думать ... еже ни, тогда «тщательнЕе надо»

Да нет, в принципе, если клетки пуповинки застимулировали- то "узкая клякса" будет на FS vs SS без распадания на сабсеты по морфологии.




как тут, к примеру.

Спасибо большое всем за подсказки и советы.
После культивирования сняли клетки с чашек, помыли и отнесли на цитометр.
Результаты обнадеживают. Видимо, проблемы были связаны с большим количеством эритроцитов в пробе. Похоже, именно они и дебрис формировали на дотплоте вытянутую кляксу - тот самый "меч" (уж простите сие искажение ввиду незнания терминологии).
По поводу "нецепляемости" меток на клетки после культивирования: причиной этому была не вязкость метилцеллюлозной среды, а большое количество "мусора", на фоне которого FACS просто "не видел" клеток. Решается добавлением лизирующего раствора (NH4Cl), до этого не лизировали - видно, поэтому в общем гамузе событий CD 45 просто терялись.
Отмывались от метилцеллюлозы просто: десятикратное разведение PBS+две крутки при 1500об/мин по 8-10мин. Клетки нормально садились на дно, после чего ресуспендировали в нужном объеме.
Совет из личного опыта: на этапе "снятия" с чашки не стоит заливать физраствор в чашку и оставлять ее в термостате - в результате получается "кисель", высосать который из чашки весьма проблематично. Вместо этого лучше подогреть физраствор до 37 градусов и в несколько приемов, раз за разом промывать им чашку.
Кроме того, предпочтительнее брать для анализа культуру "помоложе" - 13-14-й день. Культура, которой уже 18-19 дней, имеет свойство "подсыхать", а это усложняет дробление колоний и выделение клеток из метилцеллюлозы.
Сейчас жду вторую культуру, чтобы проверить свои выводы.
Удачи всем!

Хе, так вы эритроциты не лизировали? Это зря.